[发明专利]ACE2多肽

说明书

本分案申请是基于申请号为200880100650.6(国际申请号为PCT/AT2008/000211)，申请日为2008年6月12日，发明名称为“ACE2多肽”的原始中国专利申请的分案申请。

本发明涉及重组蛋白质生产的领域。

血管紧张素转化酶(ACE2)是肾素-血管紧张素系统的关键酶。它作为羧肽酶锚固于膜上，作为受体主要在肺细胞、肾细胞和心脏细胞以及内皮细胞上表达并裂解各种肽底物。知名的代表底物是血管紧张素-II(Ang II)，其被裂解为血管紧张素1-7(Ang1-7)；血管紧张素-I，其被裂解为血管紧张素1-9；同样地，还有apelin和缓激肽。Ang II和Ang1-7是肾素-血管紧张素系统的拮抗剂。ACE2通过控制肽比例而决定性地负责血管厚度的调整以及内皮细胞的通透性并因此影响有机体的内环境稳定。ACE2的表达尤其受细胞因子调节并且在各种炎症中降低，这继而导致Ang II(ACE2最重要的底物之一)的病理性增加。

ACE2用于治疗急性肺病的两种形式ARDS或ALI，随这两种病在肺中出现下调的ACE2表达。对于该种治疗使用重组的可溶性人ACE2，其被全身性给予从而在最短的时间内供整个有机体使用，以便降低增加的Ang II浓度并与此同时产生Ang1-7。这补偿了增加的Ang II浓度的负性作用。为此，很希望拥有一种产物，其具有合适的药学特征：相应地，其具有在有机体内良好的分布、药学上有意义的半衰期以及具有低免疫原性的适宜的物质。特别是该产物必须是有酶活性的、可良好溶解的以及在溶液中稳定的，并且可以以高纯度可重复地和经济地进行制备。

Tipnis等人(J Biol Chem.275(43)(2000):33238-43)描述了ACE2(在此文中还被称为ACEH)的分离和其cDNA的分离。通过在CHO细胞中进行生产获得了具有120kDa摩尔质量的糖基化的蛋白质单体。去糖基化后该蛋白质具有85kDa的质量。

Donoghue(Circ Res.87(5)(2000):1-9)描述了可溶性ACE2在CHO细胞中的表达，它没有完全被糖基化，并且表征为约90kDa的摩尔质量。此外，该文献还涉及各种ACE2序列的序列对比和抗ACE2抗体。

WO 2004/023270 A2涉及ACE2单体在昆虫细胞Sf9中表达后ACE2的结晶。在此情况下，该蛋白质的摩尔质量在质谱分析后给出89.6kDa。

有效的酶替代疗法的治疗型转变需要这样的制备方法，其经济地和可重复地制备高纯度的药学上有效的产物。ACE2的可溶的、细胞外截段包含7个N-糖基化位点。非糖基化的ACE2是不溶的，倾向于聚集，是增强的免疫原并且具有缩短的半衰期。此外，它具有小的流体力学直径，其主要地不会负面地影响纯化。因此，本发明的目的是提供具有好的体内半衰期的高活性ACE2。该目的通过权利要求的具体内容来实现。

本发明涉及重组ACE2多肽，其以二聚体存在。优选的是糖基化的重组ACE2多肽，其中ACE2多肽单体的糖基基团具有总计至少10、11、12、13、14、15或至少16个唾液酸残基，优选14个唾液酸残基，并且其中ACE2多肽以二聚体存在。同样地，本发明包含具有本文所述的糖基化的、摩尔加权平均的和进一步详细说明的ACE2单体。优选所述二聚体是同二聚体，其单体单位特别地具有相同的序列和糖基化。通常，所述单体单位是非共价结合的二聚体。单体可以通过变性步骤毫无困难地从二聚体获得。优选所有本文所述的糖基化不但涉及二聚体而且也涉及单体，包括二聚体复合物的一个或两个单体。特别优选所述二聚体包含两个锌离子。

“唾液酸残基”，特别地理解为N-乙酰神经氨酸类型(Neu5Ac)的残基，特别是在N-或O-糖基化。

原则上，对于其半衰期从而其效应而言，治疗剂的稳定性是非常重要的标准。

迄今为止，重组人ACE2仅鉴定为单体，并且在关于其功能、其晶体结构以及关于其与高特异性抑制剂相互作用的文献中也被描述为如此。

因此，例如在参考Vickers等人(J Biol Chem277(17),2002:14838-14843)的情况下，Towler等人(J Biol Chem279(17),2004:17996-18007)描述了ACE2在昆虫细胞Sf9中的表达，其在作为最后纯化步骤的小心的大小排阻色谱法之后以单体获得。单体的摩尔质量为89.6kDa。