[发明专利]一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、固相支 持物、含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液以及显色试剂；其中，所述PCR反应试剂包 括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测结核分枝杆 菌及其耐药基因突变的核酸探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交 液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交液包括锌离子、镁离子、 蛋白、非离子型表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述蛋白选自白蛋白、酪蛋白和明胶， 所述非离子型表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、 多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子 为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，蛋白占杂交液的0.1％～10％(w/v)，非离子型 表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选 地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，蛋白占杂交液的1％～5％(w/v)， 非离子型表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述显色试剂包括底物溶 液和显色缓冲溶液；其中，所述显色缓冲溶液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡 萄糖苷。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括 第一引物组，所述第一引物组包括用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物 对；其中，

用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：1所示；

用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：2所示；

用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；

用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；

每个引物对的上游引物的5’端均用生物素标记。

7.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括 第二引物组，所述第二引物组包括用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物 对；其中，

用于扩增16SrDNA的上游引物序列如SEQIDNO：3所示；

用于扩增16SrDNA的下游引物序列如SEQIDNO：4所示；

用于扩增rpoB基因的上游引物序列如SEQIDNO：5所示；

用于扩增rpoB基因的下游引物序列如SEQIDNO：6所示；

每个引物对的上游引物的5’端用生物素标记。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括用于增 强所述引物对的PCR扩增效率的加强引物对；其中，

所述加强引物对的上游引物序列如SEQIDNO：7所示，5’端生物素标记；

所述加强引物对的下游引物序列如SEQIDNO：8所示。