[发明专利]一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌，即大肠癌(Colorectal Carcinoma，简称CRC)，包括结肠癌和直肠癌，是消化道常见恶性肿瘤，在经济发达的国家如北美、西欧、澳大利亚、新西兰等国发病率较高，而在经济迅速崛起的国家和地区发病率也在迅速上升。因此，结直肠癌的早期诊断及相关诊断标志物的发掘是目前亟待解决的问题。

结直肠癌常用的筛查手段包括大便潜血试验、乙状结肠镜检查、全结肠镜检查和钡灌肠检查等。目前主要的诊断方式为结肠镜，CT仿真扫描，和病理学切片，这些方法存在对受检人群带来创伤、受检耐受性差及成本较高等问题。随着研究的深入和相关检查技术的发展，血清中的某些生物标志物，如蛋白、多肽、核酸等，不断发掘出可作为结直肠癌早期诊断的潜在标志物。目前已报道的结直肠癌血清标志物多为蛋白类，且逐渐暴露出一些弊端，如CEA检测试剂盒作为参考诊断试剂盒，敏感性约60％，特异性只有近20％左右，并且只对结直肠癌的复发及转移有参考价值，主要作为临床观察结直肠癌疗效的指标之一。因此，开发特异性和灵敏度更高的血清标志物及相关检测产品，无疑具有积极的创新价值和实用价值。

近年来，生物标志物联检在肿瘤的早期诊断中的应用研究得到很大重视。目前，被人们所认可的生物标志物多为血清蛋白标志物，也有少量解离的多肽标志物。如通过联检甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)等可显著提高肝癌诊断的阳性率。但是，蛋白标志物普遍存在疾病敏感性不强的问题。而由于解离的多肽标志物分子量小、抗原表位少，免疫原性低，存在着检测成本高、操作复杂的问题，难以单独开发成高特异性的检测标志物。值得注意的是，随着肿瘤的发生发展，会直接影响到机体某些代谢功能的絮乱，从而打破某些代谢通路中的蛋白和多肽的降解平衡，势必影响到蛋白和多肽在血清、血浆、淋巴液、尿液等体液中的存在形势和含量关系等，由此，尝试将多肽与其前体蛋白联合起来，建立一种全新的标志物联检模式，或许可以成为获取高特异性和高灵敏度肿瘤标志物的突破口。

激酶通路已广泛报道与肿瘤的代谢异常有密切关联性。激酶通路中的高分子量激肽原(High Molecular Weight Kininogen.缩写为HWMK或HK)是血浆中的一种糖蛋白，分子量120 kDa，其分子可划分为6个结构域，其中D1、D2和D3组成分子的重链，D4含有缓激肽肽段，D5和D6区组成分子的轻链。HK被激肽释放酶活化，释放D4区的缓激肽并产生双链高分子激肽原(HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。HK转变为HKa后，发生较大的构像变化，使D5区暴露更加明显，D5是HKa的活性中心，发挥HKa的主要作用，如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长与转移等。目前，有研究报道HKa蛋白可用于肿瘤早期诊断。

但是，目前对于新型的“多肽-蛋白组合式标志物”仍鲜有研究，因此，研制一种能够用于多肿瘤检测的组合式标志物检测试剂盒是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种结直肠癌相关“多肽-蛋白组合式标志物”检测试剂盒，该试剂盒能够实现对结直肠癌患者血清中HKP09/HKP15-HKa的灵敏和准确检测。

蛋白HKa和多肽HKP09、多肽HKP15同属于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system，KKS)代谢通路。本发明通过实验发现，多肽标志物HKP15和HKP09由HKa代谢产生。具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区，具体位于HKa蛋白的381～389位氨基酸，命名为HKP09。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D5区，具体位于497～511位氨基酸，命名为HKP15。HKP09和HKP15即为HKa降解，多肽HKP09和HKP15以未完全解离的形式存在于HKa表面。采用多肽及其前体蛋白两种特异性抗体，对HKP15/HKP09-HKa标志物进行定量检测，或许可以更精确的反映样品中标志物的表达情况，更加精确的区分肠癌样品与正常人样品。