[发明专利]一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法

说明书

技术领域

本发明属于水体硝酸盐污染治理与控制技术领域，具体的说是一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法。

背景技术

近几十年来，随着社会经济的迅速发展和人类活动的加剧，工业、生活、农业活动产生的大量污染物进入近岸海域，导致我国近海海域氮营养盐浓度严重超标，海域富营养化程度逐年严重，赤潮频繁发生。因此，控制近海海域的氮污染，研究水体中氮的来源以及生物地球化学循环显得尤为重要。

稳定同位素方法作为一门新兴技术，已被广泛应用于海洋学的研究。在海洋氮循环和海洋生物地球化学研究中，氮同位素有着不可替代的独特作用。稳定氮同位素组成的变化可以示踪氮的来源，判断氮的生物地球化学过程，还可以作为河口海域富营养化程度的指示参数。因此，利用稳定氮同位素方法来研究海水体系中氮的迁移、转化等环境生物地球化学过程，揭示其环境行为，具有重要的科学意义和现实意义。

为满足质谱仪进样要求，硝酸盐氮氧同位素测定前需要对硝酸盐进行预处理，目前常用的预处理方法有：高温燃烧法、叠氮化钠法、细菌反硝化法。高温燃烧法利用阴离子交换树脂吸附和富集NO₃^-，不适用于成分复杂的海水样品的预处理。叠氮化钠法利用叠氮化物将NO₃^-转化为N₂O，具有一定爆炸危险性。细菌反硝化法利用缺乏N₂O还原酶的反硝化细菌将NO₃^-转化为N₂O，通过质谱仪分析N₂O的δ¹⁵N和δ¹⁸O，前处理简单易行、操作时间短、分析成本低、所需样品量小，适用于海水样品的硝酸盐氮氧同位素测定。细菌反硝化法已在国外广泛应用，目前国内反硝化法测定硝酸盐氮氧同位素的应用很少，影响该方法在国内广泛推广的原因主要有：(1)反硝化细菌培养条件要求较为苛刻，培养不连续、不稳定均会影响样品预处理结果；(2)国内外常用的反硝化细菌培养配方中添加了硝酸盐，若细菌富集培养过程未消耗净添加的硝酸盐，会污染样品，对样品测定造成误差。(3)N₂O气体的在线连续测定一般常用Tracegas或Gasbench进行气体的预浓缩和分离，这些仪器价格较为昂贵，国内已购置这些仪器的单位较少，限制了该方法在国内的应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种海水硝酸盐氮氧稳定同位素测定的方法，利用无N₂O还原酶活性的反硝化细菌将待测海水中硝酸盐进行离线处理后转化为氧化亚氮气体，使用痕量气体预浓缩装置(Precon)-气相色谱(GC)-同位素比质谱仪(MS)联机进行氮氧稳定同位素的在线连续测定。

所述离线处理是将无N₂O还原酶活性的反硝化细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，恒温震荡(30℃，120rpm)富集培养5-10天，待细菌生长旺盛后，将菌液离心，使得菌液浓度浓缩至富集培养后菌液浓度的10-20倍，震荡混匀后加入抑泡剂(Sigma)，待用。

将上述离线处理后所得浓缩菌液置于样品瓶中，样品瓶倒置连接到曝气装置上，并通氦气吹扫菌液及样品瓶顶空气3h，而后注入待测水样使样品中硝酸盐氮含量为0.2-20μg，倒置放于恒温摇床20-30℃震荡过夜培养，培养后离心并使用Precon-GC-MS联机测定，得出N₂O氮氧稳定同位素值。

另，将上述测定的氮氧同位素测试结果进行校正，使用多点校正法，取国际原子能标准品USGS32、USGS34以及USGS32和USGS34混合配制后的标准品共五个标准品，标准品与样品一起进行同样的离线处理并同一批次测定，使用五个标准品的测量值和真值建立标准曲线，对样品测定结果进行校正。

所述无N₂O还原酶活性的反硝化细菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类学命名为pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (绿针假单胞菌金色亚种)，保藏编号为CGMCC1.3351。