[发明专利]棉花黄萎病菌致病相关蛋白及其编码基因VdPR3和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及棉花黄萎病菌致病相关蛋白及其编码基因VdPR3和其应用。

背景技术

植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因素之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大增加了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病原菌致病机制是开发新型药物和防病策略的关键。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的棉花黄萎病是一种世界性病害，是世界各主要产棉国家和地区普遍发生和危害最严重的病害之一。自1935年由引进美国斯字棉种而传入中国，并逐年传播扩散。20世纪90年代后，该病已经蔓延到包括新疆在内的各个棉区，尤其是1993年该病在我国各棉区大面积流行，发病面积高达267万hm²，造成损失皮棉1亿kg；之后又多次在我国包括新疆在内各主产棉区暴发成灾，年发生面积300万hm²左右，年经济损失约12亿元人民币。

微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染菌源，在病害循环中起重要作用，其形成的数量及存活情况直接影响黄萎病的发生为害程度。因此，明确微菌核形成与萌发机制对于深入研究棉花黄萎病病害流行规律和制定防治措施具重要意义。目前已经有VMK1、VDH1、VdGARP1、VdPKAC1和VGB等为数不多的几个基因被鉴定对大丽轮枝菌的微菌核形成和发育产生重要影响。

细胞壁作为植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。大丽轮枝菌在侵染寄主植物时产生各种细胞壁降解酶，如果胶酶、纤维素酶等，这些细胞壁降解酶能降解寄主植物的细胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传播和症状的扩展。研究表明，大丽轮枝菌菌株产生纤维素酶能力与侵染力呈显著正相关，细胞壁降解酶在大丽轮枝菌致病中作为毒力因子而起作用。应用生物信息学方法分析大丽轮枝菌VdLs.17基因组序列发现，含有大量的编码碳水化合物活性酶类(Carbohydrate-activeen-zymes)如果胶酶、纤维素酶等，这可能是大丽轮枝菌能够在广泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。

利用低致病力突变体中T-DNA插入位点侧翼序列和VdLs.17的基因组进行比对，锚定插入位点并获取相关基因详细信息，免去了多次步移获取基因全长和上下游序列的过程，可以快速构建敲除载体和互补载体，对致病相关基因进行功能分析。深入研究棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机制，为控制黄萎病的发生奠定了基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、黑色素积累、微菌核产生和纤维素酶活性中起重要作用的新基因VdPR3，通过鉴定该基因为防治棉花黄萎病害提供药物靶标。

为了解决上述技术问题，本发明提供了棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR3(Pathogenicity Related Gene)，其来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，该基因的ORF序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明同时提供了上述基因VdPR3编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明的发明人通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获得了致病力减弱的突变菌株vdpr3。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入突变体。借助TAIL-PCR技术和VdLs.17的基因组数据库，获得了T-DNA插入的侧翼序列，并从野生型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相关基因VdPR3。

本发明通过构建VdPR3敲除载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入野生型菌株Vd080，得到基因缺失突变体ΔVdPR3；在T-DNA插入突变体vdpr3中重新导入VdPR3基因，获得互补突变体ΔVdPR3-C。