[发明专利]在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧显微成像方法

说明书

技术领域

本发明属于光学显微镜技术领域，具体涉及一种在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧显微成像方法。

背景技术

单重态氧是处于第一电子激发态的氧气，其光谱学符号为O₂(a¹Δ_g)。众所周知，氧气广泛存在于我们周围的环境(大气、土壤和水体等)和生物体内,对环境和生物体有着至关重要的作用。作为氧气的第一电子激发态，单重态氧很容易在环境和生物体内产生，从而也会对环境和生物体产生深刻的影响。

目前，最为普遍的单重态氧检测方法是红外辐射法，该方法通过检测单重态氧跃迁到基态O₂(X³Σ_g^－)发出的1240nm－1340nm范围的红外发光来获得单重态氧的信息。相比于普通荧光，单重态氧的红外发光强度极其微弱。单重态氧的自发辐射寿命长达65分钟，而普通荧光的自发辐射寿命为几个纳秒，在发光分子数量同样多的情况下，单重态氧的红外发光强度仅为普通荧光强度的约10^-12倍。因此，红外辐射法在对微尺寸样品，如细胞中的单重态氧检测时遇到了极大的困难，不仅是因为单重态氧的红外发光信号随样品尺寸的缩小而迅速降低，更因为它需要在显微镜平台下进行，这样才能够获得微尺寸样品中的单重态氧的准确发光位置和在该位置上的发光强度及发光寿命等信息。

目前，在显微镜系统上对微尺寸样品和细胞中的单重态氧检测已有报导。十几年前，Peter R.Ogilby等人就在一台普通荧光显微镜上实现了多聚物和细胞的单重态氧发光强度成像(Accounts Of Chemical Research,37:894-901,2004)。相比于普通荧光显微镜，激光扫描共聚焦显微镜的优点是更高的分辨率、可对样品进行逐点扫描，不但可以获得每一点的发光强度，配以时间相关记录装置还可以测出每一点的发光寿命，从而得到单重态氧在样品中的动力学信息。但至今为止在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧成像还未能实现，原因很可能是激光扫描共聚焦显微镜中的扫描头所导致，扫描头中的复杂光学元件会大幅度衰减本来就非常微弱的单重态氧红外发光，使之无法被扫描头后的光信号检测器所探测。

发明内容

本发明的目的是提供在激光扫描共聚焦显微镜上实现单重态氧显微成像的方法。采用该方法，可在激光扫描共聚焦显微镜上获得单重态氧的发光强度成像和发光寿命成像，进而更方便于研究单重态氧与环境和生物体的相互作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

激光扫描共聚焦显微镜物镜的两端，一端为面向检测样品的样品端，另一端为激光入口端，于物镜激光入口端的前方放置一块二向分色镜，该二向分色镜能够将经物镜收集后所形成的单重态氧红外发光光束与样品的其它波段发光光束分成两束光，单重态氧红外发光光束不经过激光扫描共聚焦显微镜的扫描头而到达激光扫描共聚焦显微镜的其中一个光探测器，转化成电信号被信号记录装置记录下来而获得样品的发光强度和发光寿命的显微成像；

所述单重态氧是指处于第一电子激发态的氧气分子O₂(a¹Δ_g)；

所述单重态氧红外发光是指单重态氧跃迁到基态O₂(X³Σ_g^－)时发出的波长范围为1240nm－1340nm的红外光。

为更好地收集单重态氧红外发光，同时兼顾更好地收集其它波段发光，二向分色镜应设置于激光入口端正前方，与物镜的焦平面的夹角在30°－60°之间，以45°为佳。

二向分色镜的特点是对某波段光高透过而对另一波段光高反射，吸收则很小而基本上可忽略。通常的二向分色镜是对短波长光有利于透过而对长波长光有利于反射。为有效地将单重态氧红外发光与样品的其它波段发光分离，要求二向分色镜在1240nm－1340nm波段的反射率在45％－99.99％，相应的透过率则在0.01％－55％。二向分色镜的入射角度以45°为佳。

为便于置入显微镜中，二向分色镜为方形或圆形，其边长或直径应限定在5mm－75mm之间，厚度在0.5mm－3mm之间。