[发明专利]一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗及其构建与应用。

背景技术

禽网状内皮组织增殖症(Reticuloendoetheliosis,RE)是由反转录病毒科的禽网状内皮组织增殖症病毒(Reticuloendoetheliosis virus,REV)引起的鸡、鸭、火鸡和其它禽类的一组综合症，包括致死性网状细胞瘤、矮小综合症以及淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤。REV感染后禽生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效果，导致免疫失败。REV与鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)以及禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)已经成为鸡群中最主要的致肿瘤病毒。目前，REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中对REV阳性抗体的检出率可能高达21.4％-71.0％。

到目前为止，世界上还没有商品化地用于预防REV的疫苗，一方面是低毒力具有良好免疫原性的弱毒株没有选育出来，另一方面，灭活疫苗的免疫效果不是很理想。目前，国内外对RE疫苗的研究多集中于基因工程疫苗上。国内外对于RE相关疫苗也有所报道，Drechslor等人(Drechsler et al,2013)构建了一种能同时表达REV-env基因和禽疱疹病毒2型VP22基因的DNA疫苗，给鸡免疫后，不能起到阻止感染REV，只是提供部分的保护力。

发明内容

针对现有技术中预防REV的疫苗存在的现实，本发明的发明人结合DNA疫苗技术，提供了一种禽网状内皮组织增殖症DNA疫苗及其构建与应用，本发明将密码子优化的禽网状内皮组织增殖症病毒的env基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，克隆于pec启动子下，构建重组质粒Puc57-pec-env，质粒瞬时转染CEF后通过间接免疫荧光与荧光定量PCR可以检测到env基因的体外表达，将该重组质粒免疫SPF鸡后，鸡体可以产生较高的抗体水平，作为疫苗可以起到较好的免疫保护作用，提供了一种全新的免疫方式。

发明人首先获得了一种重组真核表达质粒Puc57-pec-env，对于该质粒，发明人将其转化大肠杆菌DH5α，即得到重组大肠埃希氏菌Puc57-pec-env，为了验证其活性，发明人将其进行了生物保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.9363，验证结果为存活。

发明人还给出了该质粒的具体构建方法，具体过程如下：

首先对REV-env基因进行了密码子优化提高了REV env基因在宿主鸡体内的表达量，经过优化后的REV-env基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

之后将该质粒分别克隆入不同启动子(PEC、CMV和SV40)的下游，并对三种质粒进行了体外表达活性的测定，最终筛选出了重组真核表达质粒Puc57-pec-env，该重组质粒在鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)中具有较强的转录活性，env基因可以在CEF中高效表达，该表达质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中含有env表达盒序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

获得上述重组真核表达质粒Puc57-pec-env后，发明人将其直接免疫SPF鸡，发现免疫后的鸡体可以产生较高的抗体水平，作为疫苗可以起到较好的免疫保护作用。

为了进一步验证该质粒转化后的活性，发明人将其转化大肠杆菌DH5α，即得到重组大肠埃希氏菌Puc57-pec-env，为了验证其活性，发明人将其进行了生物保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.9363，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2014年6月19日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.9363

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

分类命名:大肠埃希氏菌Escherichia coli