[发明专利]基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于26个线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。

背景技术

线粒体是存在于细胞质中的一种细胞器，拥有自身的遗传物质—线粒体DNA(mitochondrial DNA；mtDNA)。线粒体DNA是唯一的细胞核外遗传物质，呈闭合双环结构。和核DNA不同，线粒体DNA分子小，仅有16569个碱基对(basePair，bp)；单个细胞内拷贝数多，每个可存在10-1000个mtDNA分子；线粒体DNA突变率高，在不足2万个碱基对的线粒体基因组中具有众多的多态性位点；线粒体DNA不参与重组，其中的各多态位点作为一个整体，以单倍型(haplotype)的形式独立向下传递，表现出母系遗传特征。由于其独特的遗传学特征，线粒体DNA为法医DNA分析提供了新的遗传标记，在母系亲属之间的亲缘关系鉴定以及降解检材、陈旧骨骼、牙齿等检材的个人识别中有重要的应用价值。此外，线粒体DNA也是研究人类起源、进化和迁移的理想工具之一。多个线粒体DNA遗传标记构成的单倍型组合，能清楚的构建谱系树。各个线粒体DNA单倍群的分布具有明显的种族地理特异性，可通过线粒体DNA单倍型分析，推断未知生物样本的种族或地理来源。因此，线粒体DNA分析具有重要的法医学意义。

线粒体DNA根据其功能可分为控制区和编码区两个区域，其大部分碱基变异相对集中在控制区。因此，法医线粒体DNA分析多集中在控制区，且通常采用直接测序的方法。但是，仅对HVRI和HVRII范围内的碱基变异进行检测所获得的多态信息量很低，在法医学个体识别中的识别能力非常有限。而且，常用于检测控制区的sanger直接测序法步骤烦琐，耗时长，成本高，对待测样本DNA的含量和质量依赖性很强。对于现行法医学实验室普遍使用的毛细管电泳设备而言，sanger直接测序法使用的毛细管与常用的短串联重复序列(short tendem repeat，STR)检测使用的毛细管不同，大多法医实验室并不常备，因此难以广泛应用。为了提高线粒体DNA检测的分辨能力，有研究将控制区与编码区的多态性位点联合进行检测。但与控制区不同的是，编码区的多态性位点分布较为零散，分型一定数量的多态位点需要对较大范围的线粒体DNA进行测序。而线粒体全基因组测序无疑将获得最大的分辨能力，但是其难以应用于法医学实际案件。因此，对广泛存在于线粒体基因组的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)进行检测就成为简便而有效的办法。SNP是基因组特定核苷酸位置上单个碱基变异形成的DNA序列多态性，具有含量丰富、遗传稳定、突变率低，易于高通量检测等特点，是目前广泛应用的第三代DNA遗传标记。在法医学领域，SNP遗传标记的分型首选单碱基延伸反应技术。与sanger直接测序法相比，单碱基延伸反应技术拥有独特的优势。该技术能够一次性复合检测多个SNP，具有扩增片段小(小于200bp)，所需模板DNA量少等优点，特别适用于微量检材，降解检材和骨骼，毛发样本的检测。而且，该技术能够与当今法医遗传学实验室广泛使用的遗传标记(STR)共同应用毛细管电泳平台进行检测。因此，研究人员多采用单碱基延伸反应技术建立可同时分型多个线粒体SNP的法医学检测体系。

在已经建立的线粒体SNP检测体系中，有的是基于全球人类线粒体进化树中定义的单倍型类群特异的SNP，用以区分全世界大洲的各主要人群；有的则可以将某些人群中频率最高的单倍型类群划分至更详细的亚群；还有的方案则可以将单独依据控制区无法准确划分单倍型类群的样本，划分至正确的单倍型类群。但在这些方案中，前者几乎完全由单倍型类群特异的SNP构成，这类SNP有的会因为缺乏人群多态性而使整个方案的分辨能力降低；后两者则必须与控制区的检测联合应用。总体上，这些方案都没有在使用一组适当数目SNP的前提下，尽可能的提高分辨能力。因此，这些方案都只能作为控制区测序的补充，单独应用的价值有限，它们并不能解决控制区测序难以广泛应用的问题。

综上所述，筛选一组适宜的线粒体SNP遗传标记，应用单碱基延伸技术，构建一种适于中国人群的、快速、高效能的复合检测体系，将为法医的个人识别提供一种新的技术手段；在此基础上，开发出基于现有法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台的线粒体SNP复合检测试剂盒，将极大推动这种新技术在法医个人识别中的推广和应用。

发明内容