[发明专利]关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法和装置

说明书

本申请是申请号200880107316.3，申请日为2008年8月8日的同名申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及对将基因组材料进行分选、收集而获得的高通量样品中的蛋白和核酸逐个细胞进行自动的、关联的定量测定的方法和装置。 

相关申请 

本国际申请要求2007年8月9日提交的名称为“关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法”的临时申请No.60/954,946的权利，将所述临时申请通过引用整体并入本文。 

背景技术

荧光激活细胞分选(FACS)在研究和临床应用中广泛使用。所述仪器具有非常快速地进行多参数分析和分选的能力，但其通常需要大样品量和进行操作和维护的训练有素的操作员，且难以消毒。FACS仪器可分析少至10000个和多达几千万个细胞。而在分选应用中，进行分选的能力降低，因为样品大小小于100,000个细胞。在所有情况下，所述细胞必须事先标记。大多数情况下，使用缀合了荧光分子(如异硫氰酸荧光素，又名FITC)的抗体标记抗原或相似的膜结合蛋白，但核染色剂、胞内染料或细胞指导的荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白，又名GFP)合成也可通过流式细胞术检测。流式细胞术也适用于分子检测。例如，可将具有多种颜色和/或强度的荧光珠用作固体支持物以用于蛋白或多肽分析物的抗体捕获测定。同样，可将核酸与珠和荧光标记杂交，以使用流式细胞术来进行快速读取。在这两种情况下，在使用流式细胞术测定前进行生物化学测定，并可将所述仪器作为珠快 速读取仪使用。在某些情况下，扫描式细胞术在读取中同样有效。FACS仪器支持至所述仪器支持的独立荧光通道数的多个信息，但所述多个信息为单一类型(例如，仅表型)。 

实时聚合酶链反应(又名qPCR)是用于定量测定从目的细胞中提取的DNA和RNA的技术。使用相当于10,000～100,000个细胞的合并基因组量来进行大多数qPCR反应。研究人员对测定个细胞的遗传内容越来越感兴趣，但此努力被当前可用的高成本试剂和劳动密集性操作法所阻碍。因此，大多数单细胞PCR研究仅在少于100个上细胞进行。即使现有的机器人技术和用量为1～10μL/孔的1536微孔板仍比几百孔的花费昂贵。当出现目的细胞占细胞数量的比例少于1％的罕见情况时需要将达50000个的细胞逐一进行检查。没有大量时间和金钱的花费，目前的技术无法达到这种通量水平。 

在信号转导的研究和系统生物学的工作中，通常需要使差异信息相关联。将细胞表面受体或报告子与胞内信号转导链接的数据对这些活动越来越有价值。迄今为止，所述信息基于大量细胞相关联。通常情况下，测定数千至数百万计的细胞的表面蛋白或RNA表达，并将所述信息在统计学上相关联。在测定过程中，样品的任何异质性被平均。siRNA基因沉默之类的强大技术本身可将异质性导入样品中，从而受到此信息平均的限制。 

许多研究者已得到了逐个细胞定量关联基因型的蛋白(或其他的表型特征)和核酸的值。微流术(microfluidics)已被确定为一项能使仪器进行所述测定的技术，但还未产生作为例子的方法和仪器。 

微加工式细胞仪具有分析和分选少达1000个细胞的潜力，而在易于使用的封闭体系中随之消耗的试剂更少。当用复制酶之类的高成本试剂工作时前者是重要的。而后者是重要的，因为与常规的FACS仪器不同，其不产生气溶胶，减少污染分选细胞和与生物有害材料工作的风险。已描述了几种微加工细胞分析仪和分选仪，但大多数为“概念证明”。 

通过对微加工式细胞仪、单细胞包裹技术和适当信号处理的这些 元件进行结合，可生产出具有逐个细胞检测蛋白表达和基因表达的相关性的仪器。 

发明内容

如下所述，在微流网络中这些元件组合实现相关测定。事先标记细胞，以进行表型测定。在一实施方式中，连续流动的微流网络集成了所有功能。在微流网络的第一部分中，测定细胞的表型标记产生的荧光信号。微流网络的第二部分在微反应器中将细胞与适合基因表达测定的预定混合试剂进行独立包裹。在微流网络的下一部分中，用可包含在微反应器内容物中或从其中分离的参照信号来编码包裹的细胞流。在微流网络的第四部分中，裂解细胞，并用适宜技术(例如，实时聚合酶链反应(又名实时PCR)或qPCR)测定基因表达。然后在下一阶段解码微反应器流，且信号处理算法关联表型和基因型测定值。作为最后一个可选步骤，可分选微反应器，以富集特定基因组。在相关实施方式中，首先包裹细胞，从而表型分型和编码同时发生。随后裂解细胞，然后同时进行基因表达测定和解码。这减少微流网络上的询问点数。