[发明专利]一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及PCR、基因重组及蛋白质分析领域，特别涉及一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。

背景技术

杆状病毒多角体基因和p10基因是杆状病毒在感染宿主后的晚期产生的高水平表达蛋白。p10和多角体基因都是杆状病毒复制过程中的非必须基因，缺失这两个基因后病毒粒子仍可以完成复制和组织侵染。多角体启动子是杆状病毒极晚期超强表达启动子，现已成功应用于杆状病毒表达系统，用于外源基因的高水平表达。多角体蛋白聚合后可形成超大分子蛋白质结晶多角体。目前的研究表明多角体可保护包埋在多角体内部的病毒粒子和蛋白，使之长时间保存活性。

E25蛋白是杆状病毒的一种囊膜蛋白，其位于杆状病毒病毒粒子的囊膜。E25蛋白存在核定位信号，融合外源蛋白后可以将外源蛋白引导入细胞核并固定入病毒粒子囊膜。过量表达E25后，可提高多角体中E25的蛋白水平。

本发明利用杆状病毒这些特性，构建在多角体启动子下表达外源蛋白的重组病毒。为了不影响多角体基因的表达，通过同源重组方法将体外构建的多角体启动子外源蛋白基因替代杆状病毒自身p10基因。为了提高多角体的内部外源蛋白含量，将E25和外源蛋白融合表达。这样提高外源蛋白在多角体中的含量，为进一步开发利用杆状病毒表达创造了条件。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法。利用基因重组技术，构建在多角体启动子下E25与EGFP融合表达的重组病毒。重组病毒感染草地贪夜蛾培养细胞，使融合蛋白固定于多角体内部，并且使固定于多角体内部重组蛋白的含量上升。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

(1)按以下方法克隆e25基因：

以AcMNPV基因组为模板，利用PCR技术得到e25基因，e25基因的序列见以下网址

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/510708？report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝2&RID＝Z40W2AX3013)；PCR所用的引物分别为e25-F(5’-CGGATCCATGTGGGGAATCGTGTTACT-3’，下划线为BamHI酶切位点)和e25-R(5’-GCTCTAGACTACAGGAACAGGTGGTG-3’，下划线为XbaI酶切位点)；所述PCR扩增反应为：首先，94℃，预变性5分钟，一个循环；接下来30个循环，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒；最后，72℃延伸7分钟，1个循环。

(2)按以下方法克隆egfp基因：

以egfp基因为模板，egfp基因序列见以下网址

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/595644660？report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝5&RID＝Z40WRB21016)

利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F(5’-GCTCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3’)和egfp-R(5’-CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，)；所述PCR扩增反应同e25基因扩增反应方法一致。

(3)构建重组载体pFastBacI-egfp和pFastBacI-e25-egfp：

通过琼脂糖凝胶电泳对egfp和e25PCR产物进行分析和纯化，随后将egfp基因PCR产物经XbaI和HindIII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-egfp，随后e25基因经BamHI和XbaI酶切后PCR产物克隆入pFastBacI-egfp，获得pFastBacI-e25-egfp；利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上对所插入基因的顺序及正确性进行验证；

(4)构建重组病毒