[发明专利]一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。

背景技术

人类Y染色体长臂上存在与精子生成密切相关的无精子因子(Azoospermia factor，AZF)，无精子因子发生微小的DNA片段缺失称之为Y染色体微缺失。发生Y染色体微缺失，会引起精子生成障碍，导致少、弱、畸形精子症甚至无精子症。据WHO统计，男性原发性无精子症与少精子症患者中约10％～15％存在Y染色体微缺失。在精子生成障碍引起的男性不育患者中，Y染色微缺失的发生率是居于第二位的遗传因素。

目前，AZF被划分为3个区，即AZFa、AZFb和AZFc，这些区域的任何一个或多个缺失都将导致精子发生障碍，造成少、弱、畸形精子症甚至无精子症，最终导致不育在AZF的3个区中，每个区域均有明确的序列标签位点(Sequence tagged site，STS)可供识别；每个区域的缺失机理和缺失的断裂点均已明确。由欧洲男科协会(European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质控网(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布的1999版和2004版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》均推荐使用多重PCR-琼脂糖凝胶检测STS的方法来检测Y染色体的微缺失。同时，指南推荐每个区域检测2个STS，分别为AZFa检测sY84和sY86，AZFb检测sY127和sY134，AZFc检测sY254和sY255，若每个区域的2个STS发生缺失时，则代表该区域发生缺失；并指出通过以上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95％文献报道的AZF微缺失，足以满足常规诊断。2013年，EAA和EMQN发布新版指南，在上述指南的基础上提出Y染色体微缺失检测的流程图，并将上述的6个STS的检测定义为“基础分析”，若“基础分析”中，某个区域的2个STS发生缺失，则必须进行后续的“拓展分析”，选择该缺失区域的近端和远端断裂点上下游的STS和Y染色体远端的异染色质标签进行检测确证，判断是否该区域发生完全缺失或Y染色体异染色质化。另外，指南明确指出，不推荐检测独立的基因特异性缺失来进行Y染色体微缺失检测。

现有的产品均能检测指南推荐的6个STS，即：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255，可以满足2013版EAA/EMQN指南“基本分析”的需求，但均不能满足2013版EAA/EMQN指南的“拓展分析”需求。有些产品(如北京阅微、Promega)还含有2013版EAA/EMQN指南不推荐检测的STS或独立的基因。因此，根据2013版EAA/EMQN指南的检测流程图，这些产品的检测结果是不足以出具报告指导临床或进行遗传咨询的。

另外，现有产品采用的技术平台也具有局限性。

1)多重PCR-琼脂糖凝胶电泳。首先，琼脂糖凝胶电泳的检测方法，检测灵敏度低，产物量(上样量)较少时条带不易判别，难以区分弱阳性与阴性，容易造成假阳性或假阴性；其次，该方法的分辨率低，扩增片段之间必须达到30bp以上，才能较好区分。再者，琼脂糖凝胶电泳从制胶、上样到信号读取，均需人工操作，工作量大。

2)多重实时荧光PCR。该方法虽然具有简便、快速的优势，但需要设计特异性的检测探针并进行报告基团的修饰，难度较大且价格昂贵。

3)其他平台，如北京阅微(CN 102912028A)采用测序仪进行检测，北京海斯特(CN 103571957A)采用DHPLC进行检测。测序仪和HPLC价格昂贵，仪器操作和结果判读专业性要求高，不利于推广。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，在一次试验中同时满足“基本分析”和“拓展分析”的要求，且方便、快速、结果可靠，有效地减少操作人员的工作量，降低检测成本。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ和PCR反应液Ⅳ；

所述PCR反应液Ⅰ包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体sY254位点、sY105位点、sY1192位点、sY88位点的引物；

所述ZFX/Y位点的序列如：SEQ ID NO：1；

所述sY254位点的序列如：SEQ ID NO：2；

所述sY105位点的序列如：SEQ ID NO：3；