[发明专利]一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法

说明书

技术领域

本发明属于亚麻种质资源保存的技术领域，具体涉及一种亚麻种子的玻璃化超低温保存方法。

背景技术

亚麻(Linum usitatissimum)是世界上古老的韧皮纤维作物和油料作物，起源于近中东及地中海沿岸。亚麻在中国栽培历史悠久，是特色经济作物，亚麻纤维在五大麻纺工业原料作物中效果佳，有麻中皇后之称。亚麻种质资源是亚麻育种、科研、生产及教学等基础工作，种质资源研究的首要任务是收集种质，安全保存种质。目前，亚麻种质资源保存方式为常温、低温保存亚麻种子两种方式。常温保存的亚麻种子，每保存5年就需要重新繁种更新，因为亚麻种子经过5年的保存，活力降低很快，只有50％左右；低温保存亚麻种子，在中国，建立了国家中期库和国家作物种质库，国家中期库保存的温度为4±2℃，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5-10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18±1℃，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。

因此，为了安全保存亚麻种质资源，研究探索一种安全而长久保存亚麻种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。

刘伟伟等人(野生亚麻无性扩繁及保存技术的研究，《中国麻业科学》2008)报道了一种亚麻低温保存技术，但该技术仅仅限于4℃范围下对于亚麻的快繁材料进行42-92天的保存，并不涉及亚麻种子及超低温保存。

超低温(液氮-196℃)条件下保存植物细胞、组织或者器官等生物材料的代谢和生长活动几乎完全停止，植物材料处于相对稳定的生物学状态，不会发生遗传状态的改变或者形态潜能的丧失，理论上超低温能够无限期地保存植物材料。玻璃化超低温保存法是超低温保存法中的一种，它是将植物材料置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中处理，再投入-196℃液氮，使植物样品连同保护剂一起在快速降温过程中固化成玻璃态，并以这种玻璃态在超低温下保存。玻璃化超低温法工艺简单，操作方便，效果和重演性好是长期安全保存植物种质的一种有效安全方法，目前已经应用于大苞鞘石斛(Dendrobium wardianum)原球茎，菊花(Chrysanthemum)茎尖，马铃薯(Solanum tuberosum L)茎尖等，不同的物种，以及不同的部位进行玻璃化超低温法保存的具体要求和保存效果是有很大差异的，本发明以亚麻种子为材料，玻璃化超低温保存尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合于亚麻种子的玻璃化超低温保存法，该方法能够补充现在亚麻种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存亚麻种质资源，为亚麻种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种亚麻种子玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：室温下将亚麻种子置于装载液，装载20分钟后，取出转入装有玻璃化保护剂的冻存管中，梯度降温至-30℃—-60℃，降温速度为-1℃/分钟，然后迅速投入液氮进行超低温保存。

上述方法梯度降温优选至-40℃。

所述的梯度降温是将冻存管置于加有100％异丙醇的梯度降温盒，随后将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，梯度降温盒中的异丙醇重复使用4-5次后更新。

所述的装载液组分及配比为：含有0.4-0.6mol.L^-1蔗糖及2-2.5mol.L^-1甘油的MS液体培养液，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置。

所述的玻璃化保护剂组分及配比为：含3.25-3.50mol.L^-1甘油、2.42mol.L^-1乙二醇、1.92mol.L^-1二甲基亚砜及0.40-0.50mol.L^-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。

本发明采用的亚麻种子为当年收获鲜种，自然晒干，种子含水量为8.5-9.5％。

上述方法中亚麻种子解冻时将冻存管从液氮中取出，当室温≥20℃，自然解冻，室温＜20℃，冻存管置于30℃水浴箱中急速解冻1分钟；然后采用自来水或者蒸馏水洗涤2-3次，即可用于培养。

本发明的技术效果：

1、本发明首次以亚麻种子为材料成功的进行了玻璃化超低温保存方法的探究；