[发明专利]一种香石竹PS1基因ihpRNA载体的构建方法

权利要求书

1.一个与香石竹(Dianthus caryophyllusL.)减数分裂相关PS1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种香石竹PS1基因ihpRNA载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)香石竹PS1基因正义和内含子片段的克隆及连接、测序和转化

以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAI-2259F和PS1RNAI-2259-579introR引物对进行PCR扩增，得到香石竹PS1基因正义和内含子片段PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载体pMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测序，得到目的正义内含子片段重组子，命名为pMD-F-INTRO，正义和内含子片段的序列如SEQ ID NO：2所示；所述PS1RNAI-2259F引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，PS1RNAI-2259-579introR引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示；

(2)香石竹PS1基因反义片断的克隆及连接、测序和转化

以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAI-INVERSE-F和PS1RNAI-INVERSE-R引物对进行PCR扩增，得到香石竹PS1基因反义片断PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载体pMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测序，得到目的反义片断重组子，命名为pMD-R，反义片断的序列如SEQ ID NO：3所示；所述PS1RNAI-INVERSE-F引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，PS1RNAI-INVERSE-R引物的碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

(3)表达载体pCAMBIA1301-220.6的构建

Hind III/EcoR I双酶切pCAMBIA1301，Hind III/EcoR I双酶切pBI220.6，回收pCAMBIA1301的大片段和pBI220.6的小片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，得到改造好的表达载体pCAMBIA1301-220.6；

(4)重组载体的双酶切和回收

提取含有pMD-F-INTRO重组子质粒和pMD-R重组子质粒，pMD-F-INTRO重组子质粒用BamH Ⅰ/Kpn Ⅰ双酶切，回收香石竹PS1基因正义和内含子片段，pMD-R重组子质粒用Kpn Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切，回收香石竹PS1基因反义片断，表达载体pCAMBIA1301-220.6用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切，回收pCAMBIA1301-220.6片段；

(5)回收片段的连接

将步骤(4)回收的香石竹PS1基因正义和内含子片段、香石竹PS1基因反义片段和pCAMBIA1301-220.6片段用T4DNA连接酶连接即得香石竹PS1基因ihpRNA载体。

3.根据权利要求2香石竹PS1基因ihpRNA载体的构建方法，其特征在于：步骤(5)所述的载体构建方法为正义和内含子片断及反义片断同时连接到表达载体pCAMBIA1301-220.6中，pCAMBIA1301-220.6表达载体：香石竹PS1基因正义和内含子片断：香石竹PS1基因反义片断的摩尔比为1：3：3～3：1：1。

4.一种香石竹PS1基因ihpRNA载体，其特征在于：ihpRNA载体含有香石竹PS1基因的正义和内含子片段及反义片断；所述的香石竹PS1基因的正义和内含子片段的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述的香石竹PS1基因的反义片断的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求2所述的一种香石竹PS1基因ihpRNA表达载体的构建方法，其特征在于所述的内含子片断为PS1基因本身的内含子。

6.权利要求4所述香石竹PS1基因ihpRNA载体在提高香石竹2n配子频率方面的应用。