[发明专利]用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类肿瘤疾病的治疗方法，特别是一种专用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤（Polylineage activated killer，PAK）细胞的制备方法。

背景技术

体内回输免疫活性细胞的过继细胞治疗（Adoptive cell therapy，ACT）与传统的肿瘤治疗方法相比，可以在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下，直接杀伤肿瘤细胞；同时调节和增强机体的免疫功能，因而成为肿瘤手术、放疗和化疗的重要辅助治疗方法，为预防肿瘤复发、转移，改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的途径。ACT已在恶性黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤等肿瘤治疗中取得了一定疗效。

人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中含有多种具有杀伤肿瘤细胞活性的免疫效应细胞，如TCRgd⁺ T细胞、CD3^—CD56⁺ NK细胞、CD3⁺CD56⁺ NKT细胞及CD3⁺CD8⁺ T细胞等。这些效应细胞具有不同的识别、杀伤肿瘤细胞的特性。

1、自然杀伤（Nature killer，NK）细胞无需抗原预先致敏即可直接杀伤靶细胞，且不具有“主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex，MHC）限制性”，而肿瘤细胞往往缺乏MHC I类分子的有效表达，因此，NK细胞在抗肿瘤免疫中具有重要的作用。

2、自然杀伤样T（Natural killer T，NKT）细胞是免疫细胞中一个具有特定标志的T细胞亚群。NKT细胞表面既表达T细胞表面标志，如CD3、TCR，又表达NK细胞的表面标志，如CD56、CD122等。NKT细胞只能识别由CD1d分子递呈的特异性糖脂类分子，而不能识别由MHC分子递呈的抗原肽，比如α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide, α-GalCer）能以CD1d限制的和TCR介导的方式激活NKT细胞。经活化的NKT细胞既可直接作为抗肿瘤效应细胞发挥杀伤作用，又能通过激活其他免疫效应细胞，如NK细胞，间接实现抗肿瘤作用。

3、在人类的外周血中，大多数的T细胞表达αβ型的T细胞受体(T cell receptor，TCR)。表达有γδ型TCR的T细胞仅占外周血中CD3⁺ T细胞的5%~10%，并且在脾和淋巴结中的分布很少，而是大量地分布于粘膜相关淋巴组织（Mucosal associated lymphocytes tissue，MALT），如肠、皮肤、食管、气管、肺和生殖道上皮，是上皮内淋巴细胞（Intraepithelial lymphocyte，IEL）的主要成分之一。研究表明甲羟戊酸代谢产物如异戊烯焦磷酸（IPP）可直接作用于gdTCR，进而促使gdT细胞活化、增殖。活化的gdT细胞识别上皮来源肿瘤细胞表达的非经典MHC-I类分子MICA/MICB，这是一种不需要抗原提呈的MHC分子非依赖的途径。因此，gdT细胞可能对识别和杀伤那些逃避了αβT细胞的肿瘤细胞提供了一个选择和弥补的方式。

4、体外扩增培养的CD8⁺ T细胞表面NKG2D的表达明显上调，通过抗体封锁、间接的细胞溶解分析以及siRNA研究证实纯化的CD8⁺ T细胞抗肿瘤细胞的细胞毒作用是通过NKG2D介导的识别和信号传导，而不是通过TCR。小鼠CD8⁺CD44^high T细胞表达低水平的NKG2D受体，经IL-2激活后表达高水平的NK细胞受体NKG2D及2B4，并对表达NKG2D配体Rae-1的同基因肿瘤细胞具有极大的杀伤效应。

目前ACT多采用一种或几种效应细胞刺激剂制备免疫效应细胞，获得的免疫效应细胞的杀伤活性通常来自某一个具有特定表型的细胞群，如CIK中的CD3⁺CD56⁺ NKT细胞。肿瘤的一个非常重要的特性是其“异质性”，因此，仅采用一种具有特定表型的效应细胞难以彻底清除肿瘤细胞，其疗效及适用性较差。

发明内容