[发明专利]一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶D478N有效
| 申请号： | 201410438619.0 | 申请日： | 2014-09-01 |
| 公开（公告）号： | CN104152430A | 公开（公告）日： | 2014-11-19 |
| 发明（设计）人： | 沐万孟;江波;范晨;张涛 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N9/90 | 分类号： | C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70 |
| 代理公司： | 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104 | 代理人： | 时旭丹;刘品超 |
| 地址： | 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 催化 活性 提高 ph 降低 阿拉伯糖 异构酶 突变体 d478n | ||
1.一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N，其特征在于：将来源于Alicyclobacillus hesperidum的L-阿拉伯糖异构酶进行突变得到单突变体酶；即将原来Alhe-LAI酶基因中的第478位天冬氨酸Asp替换为天冬酰胺Asn，获得单突变体酶，命名为D478N。
2.权利要求1所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）在Alicyclobacillus hesperidum 的Alhe-LAI酶模拟结构的基础上确定突变位点；
（2）设计定点突变的突变引物，以携带Alhe-LAI酶基因的载体pET-22b（+）-Alhe-LAI为模板进行定点突变构建突变质粒pET-22b(+)-D478N；
突变引物如下所示，下划线为突变点：
上游外侧引物：5’-TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3’，
下游外侧引物：5’-TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3’，
正向突变引物：5’- GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3’，下划线为突变碱基，
反向突变引物：5’-TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3’，下划线为突变碱基；
（3）将突变质粒pET-22b(+)-D478N转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；
（4）离心菌体，重悬后超声破碎，阴离子交换柱纯化得到突变体酶D478N。
3.根据权利要求2所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述突变质粒pET-22b(+)-D478N含有Alhe-LAI的突变体酶D478N基因。
4.权利要求1所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N的应用，其特征在于：应用于化学、食品和制药领域，最适反应pH为6.0，使得底物D-半乳糖的平衡转化率提高。
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