[发明专利]一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶的突变酶制备及其应用

权利要求书

1.一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A，其特征在于：所述的突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变酶理论分子量为74.45kDa，属于糖基水解酶第18家族，由几丁质酶催化域CCD_{(Lys42-Asp452)}、类纤连蛋白Ⅲ型域Fn3D_{(Gln504-Asn558)}和几丁质酶结合域CBD_(Thr582-_Asn646)三部分构成；保守序列为“DGVDLDWE”，N末端结构域中含有一个由34个氨基酸残基组成的信号肽序列SP_(Met1-Ala34)。

2.一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A，其特征在于：所述的编码基因序列chiw50a如SEQ ID NO.2所示；所述的突变酶基因长度为2031bp。

3.一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A的制备方法，其特征在于采用以下步骤：

(1)对几丁质酶Chi9602基因序列进行同源建模和分子对接，选取50位色氨酸作为突变位点；

(2)采用重叠延伸PCR进行定点突变，突变反应分为两步。第一步，扩增突变位点两端的基因序列，得到相互之间有重叠片段的两组PCR产物；第二步，将两组PCR产物作为模板进行下一轮PCR扩增，得到需要的目的片段，所述的目的片段不包含N端信号肽序列；设计四条引物如下所示：

引物P1：5'-CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3'

Bgl II

引物P2：5'-CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3'

Pst I

引物P3：5'-TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3'

引物P4：5'-GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3'

以Bacillus thuringiensis subsp.tenebronis 9602菌株的总DNA为PCR模板，使用引物P1和P2完成第一轮PCR反应，将扩增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I进行双酶切后，连接到同样用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTrcHis B上。将此质粒命名为pMB332；

以含有chi9602片段的pMB332为模板，采用重叠延伸PCR技术第一轮PCR反应，完成第50位氨基酸的定点突变，获得几丁质酶突变酶基因W50A；所获得突变序列回收后，使用Bgl II和Pst I进行双酶切，连接到同样用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTrcHis B上，将此质粒命名为pMB581；

(3)对质粒序列进行测序后，与chi9602基因进行比较，pMB581质粒为含有突变酶基因的原核表达重组载体，其突变酶命名为ChiW50A，其氨基酸序列SEQ ID NO.1所示；

(4)用包含上述突变酶基因的重组载体转化宿主细胞，制备重组菌株，其中重组载体中原核表达载体为pTrcHis B，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli TOP10；

(5)培养重组菌株，诱导突变酶ChiW50A表达；

(6)将表达后的突变酶ChiW50A回收并采用亲和层析纯化制备突变酶ChiW50A。

4.一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A的用途，应用于植物的生物防治病虫害，其特征在于：(1)对于水稻纹枯病菌具有明显抑制作用；(2)与苏云金芽孢杆菌YBT-1520孢晶混合物复配杀棉铃虫具有增效作用；(3)与苏云金芽孢杆菌YBT-020孢晶混合物复配杀线虫具有明显增效作用。