[发明专利]一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及竹节参中β-香树素合酶(β-amyrin synthase)基因的克隆和应用，

背景技术

竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)属于五加科人参属(Panax L.)植物是传统的名贵中药材之一，具有较高的药用价值，如增强人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保护心肌等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。

竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值,目前中国竹节参的野生资源近于濒危，人工栽培药材生长周期长，造成目前市场供不应求的现状。通过研究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。

β-香树素合酶(β-amyrin synthase，βAS)基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用。βAS催化2，3-氧化角鲨烯生成β-香树素，β-香树素再经一系列生化反应生成齐墩果烷型皂苷。βAS被公认为是控制2，3-氧化角鲨烯流向齐墩果烷型皂苷合成途径的关键酶。

本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行竹节参全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到竹节参中编码β-香树素合酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能，为竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成提供理论基础。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参β-香树素合酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物生物合成的关键点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。该基因编码的酶是直接催化2，3-氧化角鲨烯行成β-香树素，而β-香树素为齐墩果烷型皂苷的前体，进而为人参属植物中齐墩果烷型皂苷含量的积累提供技术手段。

本发明的第二个目的是提供一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的最后一个目的在于提供一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因(以下称为PJβAS基因)，其制备方法如下：

利用正向引物P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3'；反向引物P2:5'TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹节参cDNA文库为模板扩增，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸90s，40个循环后，72℃延伸10min。

最终获得了PJβAS基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，其应用过程如下：

将竹节参β-香树素合酶蛋白质(SEQ ID NO.2所示)对应的PJβAS基因(优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高齐墩果烷型皂苷含量的的转基因植株。

本发明的所要保护的内容还包括：

编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含有本发明的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pBI121，pCAMBIA1301。

含有本发明的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。包括但不限于烟草细胞大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参细胞或竹节参发根细胞。