[发明专利]一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺

权利要求书

1.一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于制备工艺如下：采用乙型肝炎疫苗免疫健康献浆员后采集的乙型肝炎表面抗体效价高于标准的血浆，血浆通过低温乙醇法及压滤法分离得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，经溶解、压滤得到精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，再经溶解、调整反应参数、压滤、深层过滤、超滤、透析步骤，调整蛋白液参数至蛋白浓度为3～6%，pH为6.4～6.6，电导率为0.175～0.205s/m，使用DEAE  Sepharose Fast Flow弱阴离子交换凝胶进行上柱层析纯化，经超滤、调整pH为4.05～4.15，加入麦芽糖作为保护剂；经低pH孵放病毒灭活及DV20滤芯除病毒，二次超滤，控制麦芽糖残留量不高于2g/L，再加入甘氨酸作为保护剂，调整pH为6.6～7.2、抗-HBs效价≥100IU/ml，稀配、分装、灯检、包装、入库；制备出纯度在99.0%以上、IgG单体及二聚体总含量在98.0%以上、效价不低于100IU/ml的特异性乙型肝炎人免疫球蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的制备过程：接取10～15倍组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至3～5℃时，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5. 80～5.85，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为19%；反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀。

3.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于制备工艺如下：

（1）组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的制备

将原料血浆融化，控制血浆温度在0～4℃，在此温度下离心去除冷沉淀，去除冷沉淀的血浆加入pH 4.0缓冲液调节pH值为6.80～7.00，加-15℃以下的95%乙醇使乙醇终浓度至8%（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值应为6.80～7.20，在此条件下离心得到组分Ⅰ沉淀和组分Ⅰ上清液；组分Ⅰ上清液加入pH4.0缓冲液调节pH值为6.80～6.85，加-15℃以下的95%乙醇至乙醇浓度为20%（V/V），温度控制在-4～-6℃；加完乙醇后pH应为6.80～7.00，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液；

（2）组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的溶解、精制

接取10～15倍组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至3～5℃时，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5. 80～5.85，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为19%；反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀；

（3）精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的溶解、精制、层析

接取10～15倍精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至2～4℃时，将精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.17～5.23，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为17%；反应液最终温度控制在-5～-7℃，pH为5.24～5.30，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；在过滤过程中保持出液温度为-5～-7℃，过滤压力不超过0.2 Mpa；

压滤液上清计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为-5～-7℃，进行深层过滤，过滤出液温度控制在-5～-7℃，过滤后用1.0mol/L的盐酸调节pH为3.97～4.05，输入超滤透析罐中进行下道工序的脱醇、纯化；   

开始超滤，浓缩至蛋白含量5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.4～6.6，然后加1mol/L磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.175～0.205 s/m（T=19℃时测），调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化，层析使用DEAE Sepharose Fast Flow（弱阴离子交换凝胶）填料；层析完毕用1.0mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，开启超滤机浓缩至蛋白含量5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，使乙醇含量≤0.025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将计算量的麦芽糖加入蛋白液内，用1.0mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10±1%，pH为4.05～4.15，蛋白含量5.5±0.5％；

（4）病毒灭活、去除

配制后的蛋白液应在6小时进行除菌过滤，并应在6小时内除菌过滤完毕；除菌过滤后制品放置在低pH孵放室，经24±1℃低pH孵放21天；低pH孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；

（5）超滤、稀配、分装、灯检、包装、入库

除病毒过滤后，用2～8℃的0.85%NaCL溶液超滤，进行五倍等体积透析，透析结束后浓缩、稀配，调整甘氨酸为26～30g/L，调整制品pH值为6.6～7.2，抗-HBs效价≥100IU/ml；

二次超滤、稀配后蛋白液经0.2μm除菌滤器过滤、分装；分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；

以上所述pH4.0缓冲液是有乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9ml冰乙酸和65.6g乙酸钠；以上百分比处特别说明，其余均为重量百分比。