[发明专利]一种用于鉴定才女虫复合体种类的引物及方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于寄生虫分子鉴定领域，具体涉及一种用于鉴定才女虫复合体种类的引物及方法和应用。

背景技术

才女虫隶属于环节动物门、多毛纲、海稚虫科，是指海稚虫科中第五刚节发生变形的所有种类的合称。目前，才女虫的分类主要依靠形态特征，如粗足刺、触手、脑后脊等的形态变化等来区分不同种类。有时还需要虫体的活体形态特征，如体色、触手颜色等。由于部分才女虫能钻入贝类坚硬的贝壳内形成洞穴，要从洞穴内完整地挑出才女虫难度很大。即使获得了完整虫体，由于才女虫的活体特征变化大，且其分类的性状特征相似性高，故亦不易区分。因此，才女虫的这种分类方法不但分类鉴定的难度大，而且很容易造成对种类的错误鉴定。

与才女虫的形态学分类方法相比较，基于基因标记的分子分类方法具有更稳定的特征，且不需要完整的才女虫样品。结合才女虫的形态学特征，通过比较才女虫种间或种内的标记基因序列的相似度、遗传距离等，能够轻而易举地进行才女虫的分类鉴定。

才女虫的分子分类方法的关键是分子标记的筛选。一个理想的分子标记必须具备以下三点：(1)序列变异水平适宜，可以将不同物种彼此区分开来，同时种内变异较小；(2)分子标记两端序列高度保守，能够设计通用引物，且易于PCR扩增；(3)扩增片段长度适中，最好700bp左右。但目前还没有筛选出良好的用于才女虫分子分类方法的分子标记。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定才女虫复合体种类的引物，该引物通过才女虫线粒体基因中的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COI)设计获得，其能特异地扩增才女虫线粒体COI序列。

本发明的目的还在于提供一种利用上述引物鉴定才女虫复合体种类的方法，该方法可通过获取才女虫的COI序列数据，快速、准确地判断出才女虫的种类。

本发明的最后一个目的在于提供上述用于鉴定才女虫复合体种类的引物在鉴定才女虫复合体种类方面的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于鉴定才女虫复合体种类的引物，所述引物为引物对1或引物对2，其中引物对1由引物F1和引物R1组成，引物F1的序列如SEQ ID No.1所示，引物R1的序列如SEQ ID No.2所示，引物对2由引物F2和引物R2组成，引物F2的序列如SEQ ID No.3所示，引物R2的序列如SEQ ID No.4所示。

本发明申请人通过试验发现，才女虫线粒体基因中的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COI)最适合作为才女虫分子鉴定的分子标记。才女虫种间的COI序列遗传距离是种内遗传距离的10倍左右，分辨率极高，且能设计通用引物，易于扩增，片段长度适中。因此，COI基因是快速、准确地鉴定和区分才女虫种类的理想分子标记。

本发明上述引物对1或引物对2的设计原理是以才女虫的COI序列为引物设计模板，然后根据环节动物种类的共同COI序列作为辅助模板，设计出上述才女虫的简并引物对1或引物对2，上述引物对1或引物对2能特异地扩增才女虫线粒体COI序列。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种鉴定才女虫复合体种类的方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：设计才女虫COI序列，以才女虫COI序列为设计模板，设计上述引物对1或引物对2；

(2)DNA提取：提取不同才女虫样品的DNA；

(3)PCR扩增：以步骤(2)中提取的才女虫样品的DNA作为模板DNA，先采用上述引物对1进行PCR扩增，如扩增无条带，则采用上述引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，如采用引物对1进行扩增时，电泳结果显示在1000bp附近具有单一条带或采用引物对2进行扩增时，电泳结果显示在700bp附近具有单一条带，则说明扩增成功，如无条带、多带或条带长度不符时，则视为扩增失败；

(4)测序：取步骤(3)中扩增成功的PCR反应液，进行测序，采用双向测序，测序引物为PCR扩增时采用的引物，将测序所得序列进行拼接和比对，获得所有样品的完整序列，计算所有样品序列间的遗传距离，如两两序列的遗传距离小于0.03，则被认为是同种，如果序列间遗传距离大于0.15，则被认为是不同种。