[发明专利]一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法

权利要求书

1.一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）植物材料的选取与处理

选取野生虎杖带芽茎段切成2-4cm的小段为外植体1，并对其进行消毒处理；

（2）植物组培苗的诱导

将步骤（1）中外植体1接种于诱导培养基上，温度为25±2℃，光照强度1500-2000lux，光照时间14-16h，在25天后，将其虎杖诱导芽进行继代培养；所述的诱导培养基为MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L；

（3）组培苗继代培养

将步骤（2）中获得的诱导芽接种于继代培养基中，继续继代培养，培养条件同步骤（2）；待叶片完全张开，长至成熟组培苗后用于虎杖毛状根的培养；所述的继代培养基为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.05mg/L，pH值为5.8-6.0；

（4）虎杖毛状根的诱导及继代培养

将步骤（3）中获得的成熟组培苗叶片或茎作为外植体2用于虎杖毛状根诱导；具体步骤如下：

a、外植体2的预培养：将叶片或茎在MS空白培养基中暗培养两天；

b、菌种活化：发根农杆菌株ATCC15834在YEB培养基中活化；

c、共培养：将活化后的发根农杆菌与虎杖叶片、茎侵染10-30min后，放置MS空白培养基中加 AS20mg/L，暗培养两天；

d、除菌培养：将共培养后的叶片或茎在含有头孢噻肟钠或卡那霉素或羧苄西林钠的MS空白培养基中除菌培养，直到除菌完全，所述头孢噻肟钠浓度为10-500mg/L，卡那霉素10-300mg/L，羧苄西林钠10-300mg/L；

培养条件：温度为25±2℃，暗培养，每3-6天除菌一次，直到除菌完全；

e、继代培养：将除菌完全长出的毛状根0.1-0.5g接种于1/2MS空白液体培养基中进行继代培养2-5次，每20天继代培养一次，均在25±2℃的条件下培养；

（5）虎杖毛状根PCR检测

DNA提取：提取虎杖毛状根DNA；

PCR体系：获得含有rolB和tms引物的PCR体系；

采用琼脂糖凝胶电泳获得目标条带；

（6）生物反应器大规模培养虎杖毛状根

在1L气升式内环流发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基，另加入3%蔗糖、酸水解酪蛋白1-5g/L、NH₄NO₃ 825mg/L，黑曲霉10-100mg/L、L-苯丙氨酸15-50mg/L，接种量为湿重的30g毛状根，要求全部无菌，pH 值为5.8—6.5，温度：25±2℃，暗培养，通气量为0.05vvm条件下进行培养，在培养过程中，根据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变；

（7）虎杖毛状根的提取分离；

（8）采用HPLC测定虎杖毛状根中白藜芦醇的含量；所述的1/2MS液体培养基是指大量元素减半，但硝酸铵含量不变，其余不变，PH 5.8-6.5。

2.根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于：步骤（4）要求外植体2叶片大小为1.0cm*1.0cm，茎长为1.5cm。

3.根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于：所述的步骤（4）中将进行除菌处理后的毛状根继代培养是 在温度为25±2℃，暗培养中振荡培养，所用培养基为1/2MS空白培养基，无任何激素，摇床转速为120r/min。

4.根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于：所述的步骤（5）中虎杖毛状根中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因rolB和tms。