[发明专利]一种马铃薯干腐病的分子检测方法

说明书

所属技术领域

本发明专利涉及一种检测马铃薯干腐病致病菌的分子检测方法，属于分子生物学方法对 病原菌进行分子检测的领域。

背景技术

植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征(方中达，1998)，由于 形态特征容易受到培养条件和其它因素的影响，而且许多子实体类型经常难以获得，故给鉴 定工作带来困难。然而真菌DNA的碱基组成具有遗传稳定，不易受环境影响，在生活史任 何阶段均可获得等优点。ITS区域在不同菌株间存在丰富的变异，对ITS区进行序列分析不 仅丰富了真核生物核糖体基因ITS的序列信息，为病原菌的分类鉴定及系统发育等研究提供 了十分重要的资料和依据，同时也为建立病原菌的分子检测提供了一个准确和简便的方式， 因而越来越受到植物病理学家们的重视。利用病原菌在rDNA-ITS区段既具保守性又在科、 属、种水平上具有特异性序列的特性，对ITS区域进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计 特异性引物来检测和诊断植物病原菌，尤其是在植物病原真菌的分子检测中已越来越被广泛 应用(王继华，2004；俞大绂，1997)。

在我国对马铃薯干腐病的病原体的鉴定和检测技术，相对而言还相对落后。大多数病原体 的鉴定和检测还是停留在传统生物学的水平上，甚至有些病原菌的监测技术在免疫学和电镜 技术上还没有涉足，虽然这些传统生物学检测技术准确、直观、易于操作。但是，在检测特 定病原菌时，需要的特定鉴别寄主不易获得，且耗时费力，已经不能适应生产上快速检测的 需求，这对于马铃薯干腐病防治是一个致命的弱点。随着现代分子生物学技术的发展，除了 传统的检测方法以外，分子生物学的检测方法也得到了发展，由于PCR技术已经广泛被应用， 大大地提高了植物病害的病原菌的检出率，这对于马铃薯干腐病的病原菌的快速检测提供了 一个有效的方法。本文对马铃薯干腐病的主要致病菌的rDNA-ITS序列进行分析设计了特异 引物，利用常规PCR方法，建立马铃薯干腐病主要致病菌的分子检测体系。

马铃薯是世界性的高产作物，其经济价值在世界作物中占第四位，中国是世界上马铃薯种 植面积最大的国家。对于我国北方大部分地区，特别是黑龙江省，由于气候和土壤更适合马 铃薯的生长，马铃薯产业快速的发展起来，已经成为黑龙江省农业经济发展的重要特色产业 之一，年产量占全国的10％左右。随着马铃薯产业的不断发展，鲜薯的贮藏数量迅猛增加， 贮藏周期进一步延长，对窖藏质量要求越来越高。

镰刀菌干腐病是影响马铃薯贮藏质量的重要真菌病害，被镰刀菌侵染的薯块会出现腐烂变 质。在窖藏过程中，由于窖温较高、湿度较大，镰刀菌病会大面积发生，往往会导致“烂窖”， 一般年份损失率约15％-35％，重灾年高达50％左右，已经给我国马铃薯产业造成了巨大的经 济损失。此外，镰刀菌在侵染马铃薯的时候，还会产生大量单端孢霉烯毒素，如果大量食用 携带有毒素的薯块会造成人畜中毒。因此，马铃薯的镰刀菌病已经成为影响我国马铃薯储藏 和商品品质的重大障碍。因此，开展黑龙江省马铃薯镰刀菌干腐病病原菌分离鉴定和分子检 测技术的研究，建立灵敏度高、重复性好、定量准确、实用的镰刀菌检测体系对于早期预报 和预防马铃薯干腐病的发生，对于马铃薯种薯的储藏及商品种薯品种的保证具有重要的现实 意义。

本发明专利依据镰刀菌的rDNA区域保守序列设计特异性引物，建立了马铃薯干腐病主要 病原菌的常规PCR检测体系，从而确立一套马铃薯干腐病的快速、灵敏、准确的分子检测体 系，并在田间进行应用，本专利建立的检测方法灵敏度高、重复性好、定量准确、实用的镰 刀菌分子鉴定方法对于早期预报和预防马铃薯干腐病的发生，对于马铃薯种薯的储藏及商品 种薯品种的保证是必要的。

发明内容

本发明根据镰刀菌高度保守的rDNA序列设计分子检测的特异引物，建立马铃薯干腐病致病菌的分子 检测体系，确定了该检测体系的扩增特异性、灵敏度，并在田间进行应用；专用引物的序列为：上游引物： 5′-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3′；下游引物：5′-AAGTTCAGCGGGTATTC-3′；扩增目的片段为560bp， 扩增特异性专一，检测灵敏度可以达到1pg/μL，用于窖藏马铃薯干腐病的检测，检出率为100％。

1.技术方案

1.1试验材料与方法

1.1.1菌株和质粒