[发明专利]治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中的应用，特别是治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用。

技术背景

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又名蓝耳病，是世界范围内给养猪业造成巨大经济损失的重要传染病之一，由于猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)存在较大的遗传变异性，时常发生由于疫苗接种失败而使PRRSV再次成为原发性病原，给该病的预防和治疗带来很大困难。因此，如何有效地控制该病的流行是目前研究者和生产者面临的严峻挑战和重大课题。高效、安全的PRRS疫苗是目前蓝耳病控制措施研究中的一个焦点。但病毒的高频变异特性以及缺乏对PRRSV免疫逃逸机制及其致病的分子机制的深入认识，使得疫苗研究处于一个瓶颈时期，因此有必要建立另外一种新的抗病毒策略。

反义核酸(antisense oligonuleotides,AS-ONs)是指与靶DNA或RNA碱基互补,并能与之结合的一段DNA或RNA，一般AS-ONs长度为15～20碱基。1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因表达的设想。1978年，Paul等利用一段反义DNA寡聚核苷酸链成功地抑制了Rous肉瘤病毒的复制，引起人们极大地关注。20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，使反义核酸的研究迅速发展起来。目前，反义核酸技术作为一种有效的研究手段正被广泛地应用于功能基因组学和药物研发。

目前普遍认为反义核酸可以在复制、转录、表达3个水平上发挥作用。其机制为:(1)在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA结合，从复制与转录水平发挥反义阻止作用，这种反义技术称为“反基因治疗”(Anti-gene therapy)；(2)与mRNA的5’末端的SD序列或核糖体结合位点结合,或与mRNA的SD序列上游的非编码区结合，改变mRNA的二级结构,阻碍核糖体的结合，从而阻碍翻译；(3)作用于mRNA的poly A形成位点,阻止成熟和转运；(4)作用于mRNA的5’末端，阻止帽子结构的形成；反义核酸与靶序列结合后激活某些酶如RNAse H，将靶序列降解。一种反义核酸究竟通过何种途径发挥抑制功能，取决于反义寡核苷酸的种类是DNA还是RNA，以及是否经过修饰等具体情况。

鉴于PRRS对养猪业造成的严重危害，而以疫苗预防接种为主的防制措施存在着种种不足：如由于弱毒疫苗接种导致该病的爆发，在接种灭活疫苗猪群中爆发非典型PRRS流行等，使得人们对疫苗使用的安全性和效率提出了疑问。特异、高效的抗病毒药物在控制PRRS中的应用必然是全面控制PRRSV措施的一个良好补充。基于反义核酸在医学研究领域中的良好应用前景以及控制PRRS流行的紧迫性，特提出本项目研究的立项依据。本发明将针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的5′-非编码区，NSP9和ORF7基因的正、负链序列，运用计算机软件设计反义寡核苷酸以靶细胞的体外培养为模型，旨在开发一种新的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物，并为最终应用于临床兽医领域奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列，其序列为下列序列中的任意一个或组合使用：

YN-2：5’-ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3’

YN-3：5’-CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3’

YN-8:5’-TGCAGCATCCTCACAACCGT-3’

2、本发明采用化学合成的反义DNA序列。

3、本发明针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的5'-UTR，ORF5和NSP9基因的正、负链序列，设计多条反义DNA序列。通过显微镜观察不同处理组病毒所致细胞CPE的变化、荧光定量RT-PCR方法和间接免疫荧光等方法，从病毒mRNA和病毒蛋白水平，评价筛选所设计的反义DNA对PRRSV流行毒株增殖的影响。试验结果表明，本发明筛选出的反义DNA序列可抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖；反义DNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的可能作用机制在于：在分子水平上，反义DNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒mRNA基因的表达，从而抑制病毒蛋白增殖与感染。