[发明专利]青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是应用生物技术检测兽药残留领域，涉及了一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒。

背景技术

β-内酰胺类抗生素(β-Lactam antibiotics)是一大类含有β内酰胺环结构的抗生素。根据β内酰胺环结构差异，该类抗生素主要包括青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类等，其中青霉素类和头孢菌素类发展最为迅速，应用最为广泛。

β-内酰胺类药物主要通过抑制细胞壁黏肽合成酶，即青霉素结合蛋白活性，阻止细胞壁肽聚糖的合成，使细菌菌体破裂而产生抗菌作用。由于哺乳动物细胞无细胞壁，因此此类药物对人、畜等一般无特殊影响，对细菌宿主毒性较小。

由于该类药物药效突出，在生产中应用时也存在一些问题，诸如药物滥用、不按照休药期停药、不同药物乱配伍等，导致药物疗效降低，也对相关动物性食品安全造成了隐患。β-内酰胺类药物目前最大的问题就是引起部分不适应人群的过敏反应，造成人体健康受损甚至死亡等，此外诸如致癌、致畸、致突变等也有研究报道。

由于存在各种潜在危害，目前世界范围内都对β-内酰胺类药物在动物源性食品中的残留限量做了严格规定，其中欧盟、美国、日本和中国的限量要求基本类似，如对青霉素类药物的要求大多数在4μg/L。

β-内酰胺类抗生素残留检测技术从最初的微生物学方法、薄层色谱法、到如今的大型仪器分析法如气相色谱及气质联用法、高效液相色谱法以及液质联用法和毛细管电泳法以及免疫学分析法等均有报道。近年来，微生物传感器、电化学传感器技术和生物传感器技术等也逐步被应用于此项研究。

青霉素结合蛋白(Penicillin binding proteins,PBPs)是广泛存在于细菌表面的一种膜蛋白，是β-内酰胺类抗生素的主要作用靶位。不同细菌其种类及含量均不相同。但各种菌种的PBPs又有许多类似的结构与功能，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用。PBPs结构与数量的改变是产生细菌耐药的一个重要机制。由于能够和青霉素特异性结合，因而也被广泛应用于β-内酰胺类抗生素的残留检测中。申请号为CN201010139088.7和CN201110057523.6的中国发明专利等均是以青霉素结合蛋白2(PBP2)为基础建立了相应的检测方法，而利用青霉素结合蛋白6(PBP6)建立检测方法在公开号为CN203376330U、CN203385734U以及CN203376317U中公开了检测试纸条和试纸盒，但没有公开其制作方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒的制备方法，及其使用检测方法，以解决传统ELISA方法检测β-内酰胺类药物时漏筛的问题。

本发明的技术方案如下：

一种序列为SEQ ID NO.1所示的青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法，步骤如下：

1)青霉素结合蛋白6的重组表达载体的构建及蛋白表达

人工合成青霉素结合蛋白6基因序列，根据基因序列设计合成一对引物，在引物中引入酶切位点NdeI和XhoI，以合成的基因为模板，用合成的引物进行基因扩增，扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃延伸5min，得到的基因扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳后通过胶回收试剂盒回收扩增产物。

回收的PCR产物和原核表达载体pET28a分别用NdeI和XhoI 37℃双酶切2h，酶切后用胶回收试剂盒进行回收；将回收的基因产物和pET28a用T4连接酶16℃连接2h，将连接产物全量转化DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性单克隆提取质粒进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的单克隆进行DNA测序，对测序结果进行比对，与所需的DNA完全一致。

将重组质粒转化表达菌株BL21(DE3)中，挑取单克隆菌株摇菌，以IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达结果；大量表达后以镍柱纯化，纯化的蛋白脱盐冻于液氮中备用。

2)青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备