[发明专利]一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法

权利要求书

1.一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)预培养：切取菊芋组培苗茎尖，在含有0.3-0.4mol/L果糖的MS液体培养基中，25℃暗培养2-3天；

2)装载：预培养后的茎尖在含有2.0mol/L甘油和0.4mol/L果糖的MS液体培养基中25℃装载30-40min；

3)PVS2玻璃化保护剂处理：装载后的茎尖转入改良的PVS2玻璃化保护剂中0℃脱水处理15-40min；

4)小滴玻璃化法超低温保存：步骤3)处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加改良的PVS2玻璃化保护剂，使茎尖完全包裹于由保护剂形成的液滴中，将铝箔条置于冻存管中，然后投入液氮中保存；

5)解冻和洗涤：从液氮中取出冻存管，将铝箔条上的茎尖浸入含有1.2mol/L果糖的MS培养液中室温解冻和洗涤；

6)步骤5)处理后茎尖转入恢复培养基中恢复培养；

其中，步骤3)和4)中所述改良的PVS2玻璃化保护剂为含有30％甘油、15％二甲基亚砜、15％乙二醇和0.4mol/L果糖的MS液体培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：取4-5周苗龄的菊芋组培苗，逐层剥去外层叶片，至剩余1-2片叶原基包围茎尖分生组织，切取1.5-2mm的茎尖，在含有0.4mol/L果糖的MS液体培养基中，60rpm，25℃暗培养2-3天。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中共洗涤2次，每次10min，用含有1.2mol/L果糖的MS培养液进行洗涤。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述恢复培养基为MS+0.1mg/L GA₃+15g/L蔗糖，培养条件为：于25℃培养箱中暗培养3-5天后，转入正常光照条件下进行培养。