[发明专利]一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法

说明书

本发明涉及基因工程与生物能源领域，具体而言是一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。构建体包含至少一个脂肪烃检测元件和一个报告蛋白元件；脂肪烃检测元件由具有脂肪烃响应特性的转录激活因子和启动子组成；所述报告蛋白元件为能够在宿主中功能性表达和被检测的蛋白质。测定方法，利用所述构建体将其导入宿主细胞，再将宿主细胞进行培养并诱导其合成脂肪烃，而后通过检测报告蛋白的表达，从而实现对细胞内脂肪烃的检测。本发明方法操作步骤简单，设备要求低，可同时检测大量样品，也可用于对已知脂肪烃生物合成相关的酶和蛋白质或潜在产烃途径的进化和高通量筛选中。

技术领域

本发明涉及基因工程与生物能源领域，具体而言是一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。

背景技术

发展生物燃料是解决人类所面临的资源、能源与环境等方面问题的有效途径之一。由于脂肪烃是汽油、柴油、航空煤油等发动机燃料的主要成分，具有高能量密度、低吸湿性与低挥发性，并且与现有运输设施及发动机系统相匹配，生物脂肪烃已经被认为是一种最有潜力的优质生物燃料。

近年来，在生物体中发现的脂肪烃合成途径主要有五种，由不同的酶催化完成(Wang W,Lu X:Microbial Biosynthesis of Alka(e)nes.Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology.2013,1(10):1-5)。例如，在蓝细菌中主要存在一条两步法合成脂肪烃的途径，即脂酰ACP(fatty acyl acyl-carrier protein)在脂酰ACP还原酶(acyl acyl-carrier protein reductase，AAR)作用下生成脂肪醛，脂肪醛再经脂肪醛脱甲酰加氧酶(aldehyde-deformylating oxygenase，ADO)催化脱甲酰基生成脂肪烃和甲酸(SchirmerA,Rude MA,Li XZ,Popova E,del Cardayre SB:Microbial Biosynthesis ofAlkanes.Science2010,329(5991):559-562)。此外，在Jeotgalicoccus菌中存在一种细胞色素P450OleT，它能够直接将脂肪酸脱羧基生成具有末端不饱和双键的烯烃(Rude MA,Baron TS,Brubaker S,Alibhai M,Del Cardayre SB,Schirmer A:Terminal Olefin(1-Alkene)Biosynthesis by a Novel P450Fatty Acid Decarboxylase fromJeotgalicoccus Species.Applied And Environmental Microbiology2011,77(5):1718-1727)。目前上述途径均已实现在大肠杆菌或蓝细菌中重组表达，且成功检测到C15、C17、C19等脂肪烃的合成，表现出较好的发展前景。

一些具有天然脂肪烃生物合成途径的微生物合成脂肪烃的效率都很低，并不具备工业应用潜力。因此，通过生物工程技术手段在一些具有工业应用潜力的模式微生物中(如大肠杆菌、酵母、蓝细菌等)，大幅度提高脂肪烃的生物合成效率是当前的研究重点(KallioP,Pasztor A,Akhtar MK,Jones PR:Renewable jet fuel.Current Opinion inBiotechnology2014,26:50-55)，而实现对细胞内脂肪烃含量的快速检测是实施脂肪烃生物合成途径工程改造的一个关键性的前提条件。然而，由于细胞内脂肪烃含量极低，且通常难以和其他物质发生化学反应，使得快速检测细胞中的脂肪烃含量成为极大的难题。目前最常用也是最主要的脂肪烃检测方法是有机溶剂抽提结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析技术，该方法实验操作复杂，流程较长，仪器设备要求高，无法实现大量样品的并行分析，不能够满足原位快速与高通量检测的要求。