[发明专利]一种淀粉酶与其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种淀粉酶与其编码基因及其应用。

背景技术

淀粉酶是一类能将淀粉分子水解为由葡萄糖组成的多聚体分子的酶，它被发现广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。淀粉酶构成了工业酶的一大类，大约占有酶市场25％的份额，随着技术的发展，淀粉酶的应用范围从传统的淀粉降解、纺织、食品、发酵、造纸、酿造和蒸馏等工业领域，扩展到了临床、医药和分析化学等领域。

酶是一种生物催化剂，周围环境(温度、pH、有机试剂等)对它的活性影响很大，很多酶在一些比较苛刻的反映条件下(高温、低温或者强酸碱环境)均会失去活性，这就限制了其应用范围。为了适应更苛刻的工业生产环境需求，需要我们在尊重生物多样性的前提条件下，不断在环境中进行新的淀粉酶来源的探索。

深海热液口烟囱是通过来自地壳的熔浆与海水相互作用而形成的特殊的地质结构，该环境被认为与地球早期环境相似，为特异微生物群落的形成和演化提供了良好的环境和物质基础，使得群落显示出独特的极端环境耐受力，蕴藏了大量的生物活性物质。热液口微生物中具有很多特殊的基因和酶，在现代工业、医药、环保、材料、生物工程和国防等领域具有广阔的开发应用前景。又因其与地球上生命形成初期的环境又十分相似，因此热液口又被喻为是研究生命起源与进化的天然实验室。近年来宏基因组学技术体系的建立使从不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。

宏基因组学又叫环境基因组学或群体基因组学，是指特定环境中全部生物遗传物质的总和，利用现代基因组技术直接研究自然生态环境中的有机群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，然后根据不同环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。其中主要包括以下几个关键因素：DNA提取质量、克隆载体的选择、宿主菌的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于深海热液口的淀粉酶基因簇克隆子F_93基因ORF编码的淀粉酶、其编码基因及其在工业化生产中的应用。

其一，本发明涉及一种淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还涉及编码上述的淀粉酶的基因，其核苷酸序列具体为序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步地，用于所述的核苷酸序列特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物见序列表中SEQ ID No.3；

下游引物见序列表中SEQ ID No.4；

进一步地，本发明还包括一种表达载体，所述的表达载体含有上述核苷酸片段。

进一步地，所述的表达载体，其具体为pET-32a(+)M-F_135ORF1。

进一步地，本发明还包括一种表达工程菌，其携带有上所述的表达载体。

进一步地，所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明所述的淀粉酶，为淀粉酶基因簇克隆子F_135的开放阅读框架ORF1编码的基因，所述淀粉酶基因簇克隆子F_135的获得方法为：通过从热液口来源样品的宏基因组数据中获取了含淀粉酶序列片段，通过对这些宏基因组序列信息设计引物，对2880个克隆子进行两步法筛选，最后筛选得到克隆子F_135。

本发明对Fosmid克隆子F_135测序结果显示，该克隆子中含一个编码淀粉酶的放阅读框，命名为ORF1，全长分别为1236、，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。蛋白理论分子量为49.24，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2、所示；序列分析显示它为葡萄糖水解酶家族蛋白(GH-57家族)。

本发明根据淀粉酶ORF1基因序列，设计带酶切位点的扩增引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，将扩增后的到的片段酶切后与线性化的载体pET-32a(+)连接，构建表达质粒并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建成工程菌株。通过对工程菌株培养、诱导表达、超声破碎获得重组蛋白。

本发明的淀粉酶ORF1重组蛋白理论分子量分别为49.24kD，可以在构建的工程菌中，以包涵体形式大量表达，对包涵体进行蛋白透析复兴后，获得目标淀粉酶ORF1。

本发明通过DNS法，测得F_135中的ORF1的淀粉酶比活力为4.46U/mg。由此推断，本发明的淀粉酶在应用工业化生产等领域具有潜在的应用价值。