[发明专利]鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是危害病原。该病主要侵害产蛋鸭和雏鸭，引起产蛋鸭产蛋急剧下降和少量死亡，导致产蛋鸭高淘汰率，自2010年爆发以来严重危害养鸭业。减蛋综合症病毒(Egg Dropping Syndrome Virus，EDSV)，同样引起产蛋鸭的产蛋下降。鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒感染产蛋鸭后，引起相似的症状即产蛋下降，因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒检测方法，以便在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方法有病毒分离、琼脂扩散试验等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定量鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒两种病原体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。

鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。

探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1；探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ2。

引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为5：5：5：2：2：2。

该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；

B液：DTMUV+EDSV模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照。

A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.5μmol/L，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L。

针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的二重荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：

1)检测时间短

应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约30分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；

2)检测敏感性高且特异性强