[发明专利]纯化牛跟腱胶原蛋白的方法及其海绵的制备

说明书

本发明涉及纯化胶原蛋白的方法，目的是通过采用新的方法充分粉碎牛跟腱，纯化胶原蛋白中用调节pH析出胶原法代替盐析、透析脱盐法，海绵成型工艺中不添加化学交联剂，简易工艺流程，提高胶原蛋白的提取率，达到高合格率的胶原蛋白海绵，以及采用所述的胶原蛋白制备止血海绵。

技术领域

本发明涉及以简易工艺达到高合格率的胶原海绵的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是脊椎动物体内含量最多、分布较广的蛋白质。纤维状胶原蛋白形成所有哺乳动物结缔组织的结构基础，也是构成许多组织尤其结缔组织的主要成分，约占机体总蛋白的 25％。胶原蛋白独特的三股螺旋结构，赋予其良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性使其在医药、生物组织工程等方面展现出极大潜力。

但是，市场上的胶原海绵的价格昂贵，柔韧性比较差，且用有潜在毒性的交联剂交联，其会严重影响海绵的生物相容性。一般的胶原蛋白海绵工艺复杂，工艺流程主要包括原料预处理--提取胶原蛋白--盐析--透析脱盐--交联--冷冻干燥。工艺流程中，一方面，在盐析过程中会引入氯离子杂质，需要采用透析进行脱盐纯化胶原过程中。由于透析袋的孔径比较小，大分子胶原溶液呈粘稠状，容易堵塞膜孔，限制胶原溶液中的小分子杂质如氯离子的排出，难以实现提高胶原的纯度目的。且透析耗时较长，操作比较麻烦，如中国发明专利公开说明书CN100444902C中用0.01％～0.1％醋酸作为透析外液透析2天，每天至少换液一次，再用磷酸氢二钠溶液透析至pH达到5以上。中国发明专利公开说明书 CN101569759A用NaCl为透析外液透析，每4小时换一次透析液，透析5天。透析过程中由于杂质离子和水离子发生置换，引起透析袋的膨胀，导致膜孔变大，胶原溶液会部分析出透析袋，且透析袋会因过度膨胀而涨破，这些因素均会导致胶原溶液的损失，降低胶原的产率。若用水洗胶原代替透析法，需要重复多次水洗才能洗至加硝酸银没有出现沉淀( 图1和图2)，此操作较繁琐，且在洗涤过程中部分胶原溶液随水洗液流失，同样降低胶原的提取率。在研究过程中，我们发现将胶原提取液调节至中性可析出大量胶原(图3)，而取其上清液盐析析出的胶原量很少，调节pH对胶原析出的影响程度远远大于盐析，故可选择直接调节 pH而不盐析，减少水洗胶原的次数，进而简化工艺流程。

另一方面，若胶原溶液交联程度控制不好，会导致在去除交联剂过程中胶原海绵出现裂缝，且难以去除交联剂，如中国发明专利公开说明CN101005865A 中胶原溶液与戊二醛交联，但是要从高亲水性胶原海绵中完全清除戊二醛比较困难，需要重复多次水洗至无戊二醛，该工艺不仅复杂，而且难以彻底清除戊二醛，残留的少量戊二醛对周围细胞有害，严重影响生物相容性，造成胶原蛋白海绵的合格率降低，市场价格昂贵。

为此，本研究重点在于充分粉碎牛跟腱以提高胶原提取率，不盐析直接调节pH来纯化胶原蛋白来简化工艺，避免使用有毒的化学交联剂来提高胶原蛋白的性能，简化工艺，降低成本，提高牛跟腱的经济价值。

发明内容

本发明鉴于上述现状，目的是提供简易工艺得到高纯度，其止血效果好，修复效果好，价格低的医用胶原蛋白海绵。

解决问题的技术方案

本发明涉及采用切片机和组织搅碎机依次充分绞碎速冻的牛跟腱，再用 0.1mol/L～0.2mol/L的氢氧化钠溶液去除杂蛋白，10%～12%的异丙醇或70%～75%的乙醇溶液脱脂，使产品的脂肪含量降到最低。

本发明涉及将提取的胶原溶液的pH调节至中性，使胶原充分析出来，代替盐析胶原的方法，避免引入氯离子，再采用直接水洗的方法纯化胶原蛋白。

本发明涉及不添加交联剂，冷冻干燥得到胶原海绵的制造方法。

本发明生产工艺简单，生产成本较低，具有广泛的推广价值。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明