[发明专利]一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医学领域，尤其涉及一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法。

背景技术

梅花鹿的粘膜病，是由牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一种以发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、免疫耐受与持续感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、怀孕母牛流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传染病。许多方法被用于检测BVDV。早期检测BVDV的常规方法包括病毒分离鉴定、免疫荧光技术、酶联免疫吸附方法等，但这些方法费时、费力，实验条件要求较高，灵敏度和特异性不高。近来，PCR、LAMP等分子生物学方法被广泛用于BVDV检测，但这些方法亦存在假阳性问题。连接酶检测反应(LDR)其反应原理类似聚合酶链反应(PCR)，而反应特异性高于PCR。当探针与目的DNA互补配对后，连接酶能通过催化磷酸二酯键将相邻的两条探针连接，当探针的接头处存在碱基错配时，连接反应便不能进行。LDR技术具有特异性高、通用性好、适用范围广等特点，通过整合入其它生物技术，在生物分子检测中取得了更大的进展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，旨在解决对地区内梅花鹿粘膜病病毒流行病学调查以及净化鹿场和快速对诊断梅花鹿粘膜病进行快速诊断。

本发明是这样实现的，一种快速检测鹿粘膜病病毒BVDV的方法，包括以下步骤：

(1)探针的设计

根据BVDV的5’-UTR设计病毒特异性序列，以副猪嗜血杆菌的引物为通用引物序列，得到探针，所述探针包括：

上游探针序列(5’-3’)：

TTACCGGCGAGAAGAGTTGGGCATAGCGAGGGCATGCCCACAGCACATCT；

下游探针序列(5’-3’)：

TAACCTGGACGGGGGTCGCCTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT；

(2)BVDV的检测

通过上述上、下游探针以病毒基因组RNA反转录的cDNA模板进行LDR反应，得到连接产物；

通过上述通用引物序列以所述连接产物为模板进行PCR反应，得到扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测电泳产物确定BVDV。

优选地，在步骤(1)中，所述通用引物序列包括：

上游通用引物序列(5’-3’)：

AATGGCCGCTCTTCTCAACCCGTATC；

下游通用引物序列(5’-3’)：

CTCACGAAGGGCAATTAATGGCGGAT。

优选地，在步骤(1)中，所述病毒特异性序列包括：

上游病毒特异序列(5’-3’)：

CGAGGGCATGCCCACAGCACATCT；

下游病毒特异序列(5’-3’)：

TAACCTGGACGGGGGTCGCC。

优选地，在步骤(2)中，所述LDR反应具体为：以BVDV的cDNA为模板，进行LDR连接反应，并对LDR反应体系和反应参数进行优化，优化后的反应体系为：50μM上、下游探针各1.0μl，2U Taq DNA连接酶(40U/μl)，约20ng/μl cDNA1.0μl，10×LDR Buffer 1.0μl，ddH₂O补齐至10μl。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，68.4℃4min，10个循环。

优选地，在步骤(2)中，所述PCR反应具体为：以连接产物为模板，总体积25μl的PCR反应体系包括10×Buffer 2.5μl，25mM MgCl₂2.0μl，上游通用引物(10μM)和下游通用引物(10μM)各0.5μl，2.5mM dNTP2.0μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，LDR连接产物1.0μl。反应条件：94℃3min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，72℃5min，35个循环。反应结束后，2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。