[发明专利]一种稀磷酸结合汽爆预处理改进木质纤维酶解糖化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工及生物能源技术领域，具体涉及一种稀磷酸结合汽爆预处理改进木质纤维酶解糖化的方法。

背景技术

纤维素酶是指能降解纤维素的一类多组分复合酶系的总称，主要包括三个酶组分：内切型-β-葡聚糖酶(exdo-1，4-β-D-glucanase，EG)、外切型-β-葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，CHB)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。纤维素酶的作用机理是EG先降解纤维素分子内部的非结晶区形成新的游离末端；然后由CHB作用于纤维素线状分子非还原性末端水解β-1，4-糖苷键形成纤维二糖；最后由BG水解纤维二糖为2个葡萄糖。

在纤维素的酶解糖化过程中，若BG型酶不能有效的酶解纤维二糖，将会对EG酶和CHB酶产生很强的反馈抑制作用，最终限制纤维素的酶解糖化率。为提高纤维素酶的酶解糖化率，十分有必要通过人工措施制备具有高活性EG、CHB和BG型纤维素酶的复合纤维素酶。目前公认的能产生高活性EG和CHB型纤维素酶的菌种为里氏木霉，而该菌种所产的BG型纤维素酶活性较低。目前能产生高活性BG型纤维素酶的菌种为黑曲霉。将黑曲霉生产的β-葡聚糖苷酶与里氏木霉生产的纤维素酶复合制备出高活性复合纤维素酶，优化酶系配比，提高木质纤维素的酶解得率，具有重要的现实意义。

此外，木质纤维原料是自然界最丰富的生物质原料，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，分别占干重的38％-50％，23％-32％，15％-25％。纤维素的结晶区、高聚合度、表面空隙结构以及纤维素、半纤维素与木质素相互粘合形成紧密的交联结构，均使木质纤维难以生物降解。因此，运用高效的预处理技术破坏木质纤维原料的天然结构，解除木质素的包裹作用和降低纤维素与半纤维素的聚合度是高效水解的前提。本发明试图将稀磷酸结合蒸汽爆破预处理木质纤维，再结合制备的高活性复合纤维素酶进行发酵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用高活性复合纤维素酶处理稀磷酸结合蒸汽爆破预处理木质纤维进行发酵的方法。该方法能够明显改善酶解效果。

一种稀磷酸结合汽爆预处理改进木质纤维酶解糖化的方法，稀酸充分浸渍木质纤维原料后结合蒸汽爆破，然后将爆破物脱毒，最后采用高活性复合纤维素酶进行酶解发酵；酶解所 用的高活性复合纤维素酶的制备方法如下：分别将保藏编号为CCTCC NO：M 2012129的黑曲霉C112生产的β-葡萄糖苷酶与保藏编号为ATCC 56765的里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶浓缩提纯，并将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.048～2.685；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25～30g/L，稻草粉20～30g/L，蛋白胨5～6g/L，(NH₄)₂SO₄10～13g/L，KH₂PO₄6～8g/L，CaCl₂·2H₂O 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/L，吐温-801～2ml/L，Mandels微量元素浓缩液0.5～1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100～150ml/L，加水配制成1L。

上述方法优选将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.536；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25g/L，稻草粉30g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，KH₂PO₄6g/L，CaCl₂·2H₂O 0.9g/L，MgSO₄·7H₂O 0.9g/L，吐温-801ml/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100ml/L，加水配制成1L。

上述方法中黑曲霉C112的产β-葡萄糖苷酶的培养过程如下：将黑曲霉菌C112的种子培养液，以体积百分比5-8％的接种量接种于装有40-60ml产酶培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养4-6天，离心，取上清液得到粗酶液。