[发明专利]一种骨髓间充质干细胞及其用途

权利要求书

1.一种骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述细胞携带HIV-1受体及HIV-1协同受体。

2.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述HIV-1受体为CD4分子；所述HIV-1协同受体为CCR5分子；所述CD4分子由位于所述骨髓间充质干细胞内且核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CD4基因表达，所述CCR5分子由位于所述骨髓间充质干细胞内且核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的CCR5基因表达。

3.一种构建如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

S10，将含HIV-1受体基因和HIV-1协同受体基因的第一外源基因片段导入慢病毒表达载体中，形成重组病毒质粒，所述重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞中进行包装，产生假性病毒；

S20，从骨髓中分离骨髓间充质干细胞；

S30，用步骤S10产生的假性病毒感染经步骤S20分离出的骨髓间充质干细胞；

S40，对感染后的骨髓间充质干细胞内HIV-1受体基因及HIV-1协同受体基因进行检测与鉴定。

4.如权利要求3所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤S10还设置对照组，所述对照组是将第二外源基因导入慢病毒表达载体中形成空载重组病毒质粒，且所述第二外源基因含绿色荧光蛋白基因，不含HIV-1受体基因和HIV-1协同受体基因；所述空载重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞中进行包装产生空载病毒，并在步骤S30及S40中与所述假性病毒进行实验对照。

5.如权利要求4所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤S10中所述第二外源基因片段为CMV-GFP-Pgk-Puro，其中GFP为绿色荧光蛋白基因，CMV为启动GFP基因表达的启动子；Puro为抗性基因，Pgk为启动Puro抗性基因表达的启动子。

6.如权利要求3所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤S10中所述HIV-1受体基因为CD4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述HIV-1协同受体基因为CCR5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第一外源基因片段为CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro，其中，CMV为启动CD4基因表达的启动子；IRES序列用以连接CD4和CCR5基因，并启动CCR5基因的表达；Puro为抗性基因，Pgk为启动Puro抗性基因表达的启动子；所述慢病毒表达载体为PLV.ExBi.P质粒，所述包装质粒为pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5，所述慢病毒包装细胞为293FT细胞。

7.如权利要求6所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S10还包括对所述假性病毒进行滴度测定、PCR检测及预转染，以确保所述假性病毒能够进行感染，并能在宿主细胞中进行转录；所述步骤S20还包括应用抗体孵育对分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定。

8.如权利要求6所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S40进行检测与鉴定的具体方法为：提取感染后的骨髓间充质干细胞内的总RNA，分别进行凝胶电泳和实时定量PCR检测，以确认假性病毒携带的CD4基因和CCR5基因已经整合入骨髓间充质干细胞中，并能进行转录；提取感染后的骨髓间充质干细胞内的总蛋白质进行免疫印迹法检测，以确认CD4基因和CCR5基因能在骨髓间充质干细胞中进行表达。

9.如权利要求8所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S40还包括对感染后的骨髓间充质干细胞进行免疫荧光显微镜检测和激光共聚焦显微镜检测，观察骨髓间充质干细胞上CD4和CCR5分子的表达情况，确认CD4基因和CCR5基因已经整合入骨髓间充质干细胞中，并能进行表达。

10.一种如权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞应用于HIV-1病毒研究领域。