[发明专利]猪Six1蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种猪Six1蛋白的体外表达方法，其特征是：包括下列步骤：

(1)提取猪背最长肌总RNA；

(2)构建用于表达猪Six1蛋白的大肠杆菌重组表达载体；

(3)将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，构建携带重组表达载体的基因工程菌；

(4)培养基因工程菌至OD₆₀₀达到0.4～0.6，加入诱导剂IPTG，诱导猪Six1基因在该基因工程菌中表达；

(5)纯化表达系统表达的重组猪Six1；

(6)重组猪Six1蛋白表达形式的鉴定。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，构建载体时，克隆猪Six1基因的插入位点为Nde I和Xho I酶切位点。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，构建载体时，所用的引物序列如下所示：

上游：5’-CCCAATTCCATATGTCGATGCTGCCATCGTTCGGCTTC-3’

下游：5’-AAACTCGAGGGACCCTAAGTCCACCAGACTGGAG-3’；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)中，诱导剂IPTG浓度为2mmol/L，诱导时间为2小时。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(5)中，所述纯化是用镍柱亲和层析法中的变性条件方法进行纯化。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(6)中，所述重组猪Six1蛋白表达形式的鉴定为超生破碎法，其中超声破碎功率为260W，超声破碎2秒，间隔5秒，作用30分钟，并经SDS-PAGE电泳分析。

7.如权利要求1～6任一项所述方法所得的猪Six1蛋白，其特征在于，所述重组猪Six1蛋白C端带有6个组氨酸标签。

8.一种猪Six1多克隆抗体的制备方法，其特征是：挑取构建含有携带重组表达载体的基因工程菌，接种到4ml含有浓度为50μg/ml的卡那霉素的液体LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜活化，将活化的基因工程菌按1％接种于50ml含有浓度为50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时加入IPTG，使其终浓度为2.0mmol/L，30℃诱导2小时，菌液离心，收集菌体，经裂解、纯化后收集蛋白，将纯化后重组猪Six1蛋白作为抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，免疫前断尾采血2ml，收集血清作为阴性血清，300μg重组猪Six1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫大鼠，2周后用200μg重组猪Six1蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后免疫大鼠，每隔10天再次加强免疫，共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。