[发明专利]铜绿假单胞菌突变株构建方法及其应用

权利要求书

1.铜绿假单胞菌，其中外毒素A蛋白已被减毒，优选外毒素A 蛋白中选自以下位置的氨基酸突变或缺失：

对应于SEQIDNO：1的Lys82、His271、Arg272、His274、 Arg304、Glu578。

2.权利要求1的铜绿假单胞菌，其中其外毒素A蛋白中对应于 SEQIDNO：1的Glu578突变或缺失。

3.权利要求2的铜绿假单胞菌，其中其外毒素A蛋白中对应于 SEQIDNO：1的Glu578突变为Asp。

4.权利要求2的铜绿假单胞菌，其中其外毒素A蛋白中对应于 SEQIDNO：1的Glu578缺失。

5.制备基因工程突变菌的方法，包括：

(1)从细菌基因组中的待突变基因扩增第一片段和第二片段，所 述第一片段含有从该基因第一端至突变位点前的序列，而第二片段 含有该基因另一端编码区之外的序列，例如第一片段为该基因中突 变位点前的上游序列，而第二片段为该基因编码区之后的序列，或 者第一片段为该基因中突变位点之后的下游序列，而第二片段为该 基因编码区之前的序列；

(2)将第一片段和第二片段插入转移载体中，所述转移载体优选 能通过细菌间基因转移、更优选通过细菌间接合转移而从供体菌转 移到受体菌，所述转移载体含有第一抗性基因和第二抗性基因，并 且第一抗性基因两侧带有同源重组位点LoxP，第一片段和第二片段 插入到LoxP-第一抗性基因-LoxP两侧用作同源臂，构建缺失载体， 所述载体例如为质粒；

(3)通过设计在突变位点带有突变的引物，经由PCR扩增引入所 述突变，将含有从基因第一端至突变位点前的(例如上游序列或下游 序列)、突变位点的所述突变以及突变位点后到基因另一端(例如终 止子)的序列(例如下游序列或上游序列)的序列，利用同源重组，将 其插入到所述转移载体中，替换转移载体中第一抗性基因和一个 loxP位点，构建突变载体；

(4)将能促进细菌间基因转移、优选细菌间接合转移的辅助菌、 作为供体菌的含有缺失载体的细菌和作为受体菌的待突变细菌一起 培养，筛选通过同源重组而具有第一抗性但无第二抗性的第一重组 子，第一重组子在带突变基因中自突变位点至终止子的序列被 LoxP-第一抗性基因-LoxP所取代，其中所述辅助菌优选能促进细菌 间接合转移的细菌，更优选含有质粒pRK2013的大肠杆菌，如大肠 杆菌HB101；

(5)将能促进细菌间基因转移的辅助菌、作为供体菌的含有待转 移的突变载体的细菌和作为受体菌的第一重组子一起培养，筛选以 突变位点前的上游序列作为同源臂、通过同源重组经过单杂交而产 生的具有第二抗性而无第一抗性的第二重组子，第二重组子含有带 有所述突变的完整的突变基因并且含有整个突变载体，其中所述辅 助菌优选能促进细菌间接合转移的细菌，更优选大肠杆菌 HB101(pRK2013)；

(6)将带有第三抗性基因的Cre表达载体引入第二重组子中，筛 选具有第三抗性而无第一抗性和第二抗性的第三重组子，在第三重 组子中庆大霉素抗性和四环素抗性这两个抗性基因以及其他的载体 序列通过重组已被缺失；

(7)培养第三重组子，选择丢失了Cre表达载体的第三抗性为阴 性的菌株，得到所述基因被突变的基因工程菌，

所述基因工程突变菌优选为铜绿假单胞菌，更优选为外毒素A 蛋白减毒菌。

6.权利要求5的方法，其中所述基因工程突变菌为铜绿假单胞 菌，其外毒素A蛋白已被减毒，优选外毒素A蛋白中选自以下位置 的氨基酸突变或缺失：

对应于SEQIDNO：1的Lys82、His271、Arg272、His274、 Arg304、Glu578。

7.用权利要求5或6的方法制备的铜绿假单胞菌基因工程减毒 菌，所述减毒菌优选为外毒素A蛋白减毒菌。

8.铜绿假单胞菌外毒素A蛋白，所述蛋白是从权利要求1-4中 任一项的铜绿假单胞菌或权利要求7的铜绿假单胞菌基因工程减毒 菌中分离的。