[发明专利]埃博拉五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)，其包括：

(1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，

靶核酸引物对包括

GCCACTCACGGACAATGACA，

GCATGCGAGGGCTGGTT，

GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，

TGAGGAGACGTGCAAATGGA，

ACCTCCGACGCGGTACAC，

TGTGGGTGAACAGGAACATCA，

GACCCGGATGATGGCAGAT，

GGCATTCGCCGTCTCACTA，

GCACCGAGGCCCAGAAC，和

CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，

靶核酸探针包括：

AAGAAATGAACCCTCCGGC，

CAAGCATGGAGAATAT，

CAAGACAGGCAACCTA，

CAACAATTATGGAGACTATC，和

TACGACCGCCAATCG；

(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，

(3)根据荧光检测结果判断是否有靶核酸存在于核酸提取液中。

2.权利要求1所述的方法，其是非诊断方法。

3.权利要求1所述的方法，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5。

4.权利要求1所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。

5.权利要求1所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。

6.权利要求2所述的方法，其中核酸提取液是对样品采用磁珠提取法提取的。

7.用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，

靶核酸引物对包括

GCCACTCACGGACAATGACA，

GCATGCGAGGGCTGGTT，

GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，

TGAGGAGACGTGCAAATGGA，

ACCTCCGACGCGGTACAC，

TGTGGGTGAACAGGAACATCA，

GACCCGGATGATGGCAGAT，

GGCATTCGCCGTCTCACTA，

GCACCGAGGCCCAGAAC，和

CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，

靶核酸探针包括：

AAGAAATGAACCCTCCGGC，

CAAGCATGGAGAATAT，

CAAGACAGGCAACCTA，

CAACAATTATGGAGACTATC，和

TACGACCGCCAATCG。

8.权利要求7所述的试剂盒，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5。

9.权利要求7所述的试剂盒，其还包括磁珠提取法所需试剂。

10.权利要求7～9之任一所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品(优选是用于权利要求1-6之任一所述的方法的检测试剂产品)中的应用。

11.互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针选自

GCCACTCACGGACAATGACA，

GCATGCGAGGGCTGGTT，

GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，

TGAGGAGACGTGCAAATGGA，

ACCTCCGACGCGGTACAC，

TGTGGGTGAACAGGAACATCA，

GACCCGGATGATGGCAGAT，

GGCATTCGCCGTCTCACTA，

GCACCGAGGCCCAGAAC，

CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，

AAGAAATGAACCCTCCGGC，

CAAGCATGGAGAATAT，

CAAGACAGGCAACCTA，

CAACAATTATGGAGACTATC，和

TACGACCGCCAATCG。