[发明专利]利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及应用

权利要求书

1.一种利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法，其特征是首先取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲洗干净后，用微型角膜刀切取厚度100～500微米的角膜片；再用低渗溶液对切取的角膜片溶胀2～3小时，去除角膜上皮层，获得角膜基质片；再将该角膜基质片在-80℃冰箱冻1～2小时后，于37℃融化10～30分钟，冻融重复3～5遍；然后用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15～20分钟；

再将冻融漂洗后的角膜基质片放入溶于DNA-RNA酶溶液，于37℃处理2～4小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15～20分钟，再用超纯水漂洗15～20分钟，获得脱细胞角膜基质片；

然后将脱细胞角膜基质片浸入角膜专用交联剂溶液中，于37℃浸泡处理20～30分钟后，利用波长310～400纳米的紫外光照射20～30分钟，照射距离为2～10厘米；之后用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，每次15～20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15～20分钟；

最后将交联漂洗后的脱细胞角膜基质片平铺于24孔培养板中，风干48～72小时后使用剂量为14～25kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜的载体支架。

2.如权利要求1所述的制备组织工程角膜载体支架的方法，其特征是上述DNA-RNA酶溶液的配方：100mM Tris-HCl缓冲液，调pH至7.5，25mM MgCl₂，1mM CaCl₂，5～7单位/毫升DNase I，5～7微克/毫升RNase A。

3.如权利要求1所述的制备组织工程角膜载体支架的方法，其特征是上述角膜专用交联剂溶液的配方为：10～20％(w/v)右旋糖苷溶液，0.1～0.2％(w/v)核黄素。

4.如权利要求3所述的制备组织工程角膜载体支架的方法，其特征是上述交联剂溶液的配方又添加了1～2％妥布霉素。

5.如权利要求1所述的制备组织工程角膜载体支架的方法，其特征是上述低渗溶液的配方：0.1～0.3％(w/v)KCl溶液。

6.如权利要求1所述的制备组织工程角膜载体支架的方法，其特征是上述漂洗缓冲液的配方：100mM Tris-HCl缓冲液，调pH至7.5。

7.权利要求1所制备的组织工程角膜载体支架作为组织工程角膜上皮、基质、内皮、前板层半角膜、后板层半角膜和全层角膜的载体支架应用。

8.权利要求1所制备组织工程角膜载体支架，其特征是用作人角膜基质的替代物而用于未累及全层的角膜溃疡的临床移植和治疗。