[发明专利]一种基于分光光度法的活芽孢含量高通量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于分光光度法的检测活芽孢含量的高通量检测方法，属于现代微生物学技术和发酵工程技术领域。

背景技术

芽孢是某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成的圆形或椭圆形的抗逆性内生休眠体。芽孢对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性，可耐受各种不良甚至极端环境。

芽孢杆菌属是一个重要的与人类关系极为密切的微生物类群。芽孢杆菌包含许多有特殊功能的菌株，在工业、农业、医学等科学领域研究中有广泛的应用价值，越来越引起人们重视和研究。芽孢杆菌在农业有着广泛的应用，以蜡状芽孢杆菌为代表的诸多种类可做饲料用微生物添加剂，提高饲料利用率，降低饲料成本，减少牲畜疾病发生；很多生物农药也由芽孢杆菌制成，芽孢杆菌的许多种类是昆虫的病原菌或者具有杀虫活性，如蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌，尤其苏云金芽孢杆菌及其伴胞晶体是农业上良好的杀虫剂，已成为世界上产量最大的生物农药。另外，根据微生态学原理，对人体无害甚至有益的芽孢杆菌还可以作为保健品或药品服用，促进恢复菌群平衡，防治疾病和提高人类健康水平；很多芽孢杆菌尤其是嗜碱性芽孢杆菌在强碱性环境中具有出色的矿化能力，近年来还被用于建筑材料裂缝的修复与自修复研究。

由于芽孢具有对不良环境的抗逆性，芽孢杆菌生物制剂大都采用芽孢的形式制备，以确保在长时间内具有稳定的生物活性。而活芽孢含量是芽孢杆菌生物制剂质量的重要指标。

传统的检测活芽孢含量的方法是基于浓度梯度稀释和平板培养的活菌菌落计数法。然而，该方法需要进行大量的稀释、涂板、培养、计数等工作，存在工作量大、周期长、效率低和成本高等缺点。

芽孢一旦遇到合适的环境，就会迅速萌发，从休眠状态转化为营养生长状态。芽孢可以被诸如肌苷、L-丙氨酸、葡萄糖、十二烷胺等物质诱导萌发。芽孢的含水量低(40％)，具有厚而致密的多层结构，折光性很强，而在萌发过程中，这些多层结构吸水膨胀、折光性消失，导致光吸收下降。因此以光吸收下降作为芽孢萌发活性的表征，用于评价芽孢繁殖活力的大小，可以大大简化活芽孢含量检测流程，克服传统方法的固有缺点。

发明内容

为了克服检测活芽孢含量通常所采用的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本发明提供了一种基于非培养和酶标仪光吸收检测的高通量检测方法。

高通量检测活芽孢含量的方法如下：

采用合适的培养条件培养待测菌种，芽孢比率达到95％以上时，取发酵液4000-6000×g离心10-20min，加入去离子水，制备高存活率的萌发芽孢水悬液，通过调整加入去离子水的体积，调整其OD₄₉₀值为0.5-1.7；采用传统活菌菌落计数法检测该芽孢悬液的活芽孢浓度；

选择一种在待测菌种芽孢萌发条件下不能萌发的产芽孢菌种作为非萌发芽孢的来源，采用合适的培养条件进行培养，通过4000-6000×g离心10-20min，加入去离子水，制备两种不同芽孢浓度的非萌发芽孢水悬液：一种的OD₄₉₀与高存活率待测芽孢水悬液相同，用于制备标准曲线；另一种芽孢浓度高达1×10¹⁰-5×10¹⁰个/ml，用作待测样品的光密度调节剂。

将上述萌发芽孢水悬液和非萌发芽孢水悬液分别以0：10，1：9，2：8，4：6，6：4，8：2，10：0的体积比混匀，制备萌发芽孢比率占总芽孢比率分别为0％，10％，20％，40％，60％，80％，100％的芽孢悬浮液，若(a)步骤中所获得的萌发芽孢水悬液活芽孢浓度为A个/ml，以上梯度浓度芽孢悬液的活芽孢浓度依次为则0，0.1A，0.2A，0.4A，0.6A，0.8A，A。将以上芽孢悬浮液放入水浴锅热激处理，60-80℃加热10-30分钟。热激处理后分别取10-190μL加入多孔板中，再加入一定体积萌发缓冲液补足至200-300μL，混匀，制成萌发反应液，利用酶标仪检测反应液的初始OD值，之后将多孔板放于28-37℃恒温培养箱中反应1.5-3小时后，检测终点OD值，计算不同芽孢悬浮液的OD下降值，以OD下降值为横坐标，相应的活的萌发芽孢浓度作为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合获得标准曲线公式。