[发明专利]一种冻存液及其用途和保藏脐带间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，具体地，涉及一种用于保藏干细胞的冻存液、该冻存液的用途和保藏脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的未分化或低分化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

间充质干细胞以一种多能干细胞，是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，具有较高的临床应用价值。

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞。从人脐带中分离出的脐带间充质干细胞，其细胞含量和增殖能力均优于骨髓间充质干细胞，并且免疫原性比骨髓间充质干细胞低，此外还具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。

在实际临床应用中，脐带间充质干细胞的足够数量是保证干细胞治疗的必要因素。在体外对脐带间充质干细胞进行扩增是增加脐带间充质干细胞的数量的必要途径。但是，目前脐带间充质干细胞只能在体外传代15-20代，并且传代后3天以上才能达到80％以上的融合度，此外在传代15代以后还会出现丢失分化潜能的现象。因此，现有的培养脐带间充质干细胞的方法存在扩增能力差的缺陷。此外，脐带间充质干细胞在冻存以后，扩增能力会出现下降。

发明内容

本发明的目的是克服脐带间充质干细胞在冻存以后，扩增能力会出现下降的缺陷，提供一种用于保藏干细胞的冻存液、该冻存液的用途和保藏脐带间充质干细胞的方法。

本发明的发明人发现，通过在基础培养基中添加特定的抗体和ATP，能够大幅度地提高脐带间充质干细胞的扩增能力，并且，在冻存液中也添加特定的抗体和ATP，能够大幅度地提高冻存后的脐带间充质干细胞的扩增能力，由此得到了本发明。

一方面，本发明提供了一种用于保藏干细胞的冻存液，该冻存液由二甲基亚砜和生长培养基混合得到，二甲基亚砜和所述生长培养基的体积比为(0.05-0.4)∶1；所述生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。

另一方面，本发明还提供了一种保藏脐带间充质干细胞的方法，该方法包括：将脐带间充质干细胞悬浮于如上所述的冻存液中，然后在零下200℃至零下70℃的温度中保藏。

再一方面，本发明还提供了如上所述的冻存液在保藏脐带间充质干细胞中的用途。

通过上述技术方案，本发明能够大幅度地提升冻存后的脐带间充质干细胞在体外的扩增能力。例如，本发明能够将冻存后的脐带间充质干细胞的体外传代数提高到25-40代，并且传代后40-60小时内能达到80％以上的融合度，此外在传代20代以后也不会出现丢失分化潜能的现象。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是测试实施例1中不同的生长培养基中生长的脐带间充质干细胞的生长曲线图。图1中，1和2表示制备实施例1和2，3-6分别表示制备对比例1-4，横坐标表示生长时间，纵坐标表示550nm处测定各孔吸光光度值(D值)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的液体的体积数值为20℃下的数值；使用的气体的体积数值为20℃和1个标准大气压下的数值。