[发明专利]一种CYP2D6基因多位点突变检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及CYP2D6基因多位点的检测方法，该方法可以快速高效准确的检测CYP2D6基因的8个功能性单体型变异。

背景技术

据世界卫生组织(WHO)公布，世界各国住院患者发生药物不良反应的比例为10％-20％，其中5％的患者死于严重药物不良反应。我国发生药物不良反应的患者占住院患者的10％-30％，每年因药物不良反应入院的患者达500万人次，每年约有19万人死于药物不良反应。因此药物基因组学研究已经成为当前全球热点，个体化用药、个体化治疗更是各种医药生物国际学术会议的讨论重点。

CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一，占肝脏酶总量的2％～9％，但是参与20％～30％药物的代谢，包括β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药(如销售额最大的阿立哌唑)、镇痛药等。CYP2D6基因存在多态性，目前发现CYP2D6超过100个突变位点，但影响中国人CYP2D6功能的常见突变有8个，包括酶活性正常型等位基因*1、*2，快代谢型基因变异为基因重复变异，慢代谢型基因变异*3、*4、*5，中代谢型基因变异*9、*10、*14、*41。这些基因基因突变可引起酶活性和数量的差异，从而影响药物的疗效个体差异，导致疗效不足或毒副作用的产生。

目前国内外的检测CYP2D6基因突变的产品，如Amersham Bioscience(GE healthcare)的CodeLink P450，Roche的AmpliChip CYP450 Test等，主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。另外，这些方法所需的检测时间较长，耗费人力，从核酸提取到结果获取超过8小时，超过1天正常工作时间。而其它以PCR为基础的检测基因突变的技术，如直接测序法，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。与上述液相芯片法和基因芯片法相比，荧光PCR法没有PCR后处理，大大节省时间与人力。从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。但传统的荧光PCR技术及产品往往只是针对单一位点设计，不能同时获得多个位点信息。

发明内容

本发明的目的在于根据目前检测CYP2D6的方法中存在的上述缺陷，提供一种基于Taqman的等位基因差异分析法，提供CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性单体型变异的检测方法，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99％以上等优点。

本发明另一目的在于提供上述检测方法的结果判定方法。

本发明还有一个目的在于提供一种使用上述检测方法检测的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

CYP2D6的基因多态性及功能和分布频率如表1所示。

一种CYP2D6基因多位点突变检测方法，包括如下步骤：

(1)提取CYP2D6基因组DNA作为模板；

(2)设计特异性引物和探针：

CYP2D6*2的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；

CYP2D6*3的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸系列如SEQ ID NO:7～8所示；

CYP2D6*4的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；

CYP2D6*5在基因缺失时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15；

CYP2D6在基因重复时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

参比基因ALB的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；