[发明专利]AXMI-IL5、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163 和AXMI-184∶VIP3A 杀虫蛋白及其使用方法

说明书

本申请为2009年7月2日提交的、发明名称为“AXMI-IL5、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184∶VIP3A杀虫蛋白及其使用方法”的PCT申请PCT/US2009/049527的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年12月17日，申请号为200980123077.5。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂以及生产转基因的抗害虫植物。

发明背景

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它能产生对某些目和种的昆虫有特异性毒性，但是对植物和其他非靶向生物体无害的晶状包含体。因此，包含苏云金杆菌菌株或它们的杀虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀虫剂以控制农业虫害或针对多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目，双翅目和鞘翅目幼虫的有效杀虫活性。这些蛋白质还显示出抗膜翅目，同翅目，虱目，食毛目和螨害虫目，以及如线虫，扁形动物和Sarcomastigorphora等其他无脊椎动物目的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。这些蛋白质主要基于它们的杀虫活性而最初被划分为CryI到CryV。这些主要的类别是鳞翅目特异性的(I)，鳞翅目和双翅目特异性的(II)，鞘翅目特异性的(III)，双翅目特异性的(Ⅳ)，以及线虫特异性的(V)和(VI)。所述蛋白质被进一步划分为亚家族；各个家族内更密切相关的蛋白质被指派上分类字母，如Cry1A，Cry1B，Cry1C等等。在各亚类内更紧密相关的蛋白质则命名为如Cry1Cl，Cry1C2等等。

最近出现了一种针对Cry基因的新命名法，其基于的是氨基酸序列同源性而非昆虫靶特异性(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。在该新的分类法中，每种毒素被分配了一个独特的名称，其中合并了第一分类(阿拉伯数字)、第二分类(大写字母)、第三分类(小写字母)和第四分类(另一个阿拉伯数字)。在该新的分类法中，罗马数字被转换成第一分类的阿拉伯数字。序列同一性小于45％的蛋白质具有不同的第一分类，而对于第二和第三分类而言这一标准分别为78％和95％。

晶体蛋白在已经被摄取和在昆虫中肠溶解前不显示杀虫活性。被摄取的前毒素在昆虫消化道内经蛋白酶水解成活性的毒性分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。此毒素与靶幼虫中肠内的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(参见，例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成，并涉及膜插入和孔形成。结构域Ⅱ由排列成“希腊语key”构型的3个β折叠片组成，而结构域III由“薄卷饼型(非同源蛋白质折叠)”形式的两个反向平行β折叠组成(de Maagd等人,2001，同上文)。结构域II和III涉及受体识别和结合，并因此被认为是毒素特异性的决定簇。

除了δ-内毒素以外，还有几种其他已知类型的杀虫蛋白毒素。VIP1/VIP2毒素(见，例如，美国专利5,770,696)为二元杀虫毒素，认为其通过类似其他二元(“A/B”)毒素的作用模式的、涉及受体介导的胞吞和之后的细胞毒化机制对昆虫展示强活性。A/B毒素例如VIP、C2、CDT、CST或炭疽杆菌(B.anthracis)水肿和致命毒素首先通过特异性受体介导的与单体形式的“B”组分结合与靶细胞发生相互作用。这些单体之后形成同型七聚体。之后“B”七聚体-受体复合物作为对接平台接着结合“A”酶组分并通过受体介导的胞吞将其运输至胞浆。一旦进入细胞的胞浆，“A”组分通过例如G肌动蛋白的ADP核糖基化或提高环腺苷酸(cAMP)的胞内水平抑制正常细胞功能。见Barth等人(2004)Microbiol Mol Biol Rev68:373--402。