[发明专利]一种低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法

权利要求书

1.利用低聚半乳糖和唾液酸通过CMP-Sia合成酶和唾液酸转移酶合成的HMO类似物，具有如下的结构：

Pmst1酶催化合成的2,3-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物

Sia-a2,3-(Gal)n-Glc（n=1-7）

Pd2,6ST酶催化合成的2,6-唾液酸连接GOS唾液酸衍生物

Sia-a2,6-(Gal)n-Glc（n=1-7）

CSTII酶催化合成的2,3/8-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物

(Sia-a2,8)m-Sia-a2,3-(Gal)n-Glc（n=1-7）。

2.权利要求1所述HMO类似物的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：

酶法转化：利用生物酶在一定条件下作用于低聚半乳糖溶液，生成低聚半乳糖的唾液酸衍生物的混合物；其中所述的低聚半乳糖与生物酶的重量比例为：

      NMCSS/GOS=146ug/100mg；PMST1/GOS=172ug/100mg；

Pd2,6ST/GOS=272ug/100mg；CSTⅡ/GOS=616ug/100mg；

所述生物酶指的是：CMP-Sia合成酶NMCSS和PMST1、Pd2,6ST、CSTⅡ中的一种；

酶分离：将反应产物煮沸终止反应，12000r/min离心20分钟，分离变性的酶和反应中的沉淀物，取上清液；

底物和副产物的降解：将分离出的上清液用碱性磷酸酶处理，将反应中未完全反应的CTP、CMP、CMP-Sia降解为胞苷，采用HPLC检测；

分离纯化：将（c）制得的上清液，经分离、冻干后，制得低聚半乳糖的唾液酸纯化后产物。

3.权利要求1所述HMO类似物的合成方法，其中步骤（a）中所述的生物酶指的是：以 (Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)作为底物；由来源于微生物中的两种酶通过“一锅双酶法”来催化合成反应，合成三种不同的低聚半乳糖的唾液酸衍生物。

4.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述作为底物的浓度为20mM/L；PMST1、Pd2,6ST催化的反应的CTP和Neu5Ac的浓度为40mM，CSTⅡ催化的反应的CTP和Neu5Ac的浓度为100mM，pH8 Tris-Hcl的浓度为100mM，Mg²⁺浓度为20mM反应的温度为37℃，反应时间为1-2h。

5.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述步骤（c）中HPLC的检测以磷酸盐缓冲液，C18柱，260nm吸收波长进行检测；所述的磷酸盐缓冲液指的是：磷酸氢二钠35.8ｇ、磷酸二氢钾13.6g加水900ml溶解用氢氧化钠溶液，调节pH至7.0，加入1.61g四甲基溴化铵，加水至1000ml。

6.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述步骤（d）中分离纯化：用规格15mm ID×100cm 的Bio-gel P2 色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，色谱分离的样品上样量为1-2mL，洗脱流速为0.4-1 mL/min；最优的样品上样量为1mL，洗脱流速为1-2mL/min，收集洗脱样品。

7.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述步骤（a）和（d）中还包括分离后的薄层层析检测、合并迁移距离相同的产物的步骤；其薄层层析检测的步骤如下：

取0.5μL 洗脱液，薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于酒精灯上显色；上述展层剂由乙酸乙酯：甲醇：水按体积比4 ：2：1混合配制；显色剂的配制为冰乙酸、茴香醛、浓硫酸和乙醇，体积分别为5.5ml、16ml、27ml和500ml。