[发明专利]毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法

权利要求书

1.一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）茎尖包埋干燥超低温冷冻保存：取继代腋芽饱满的组培苗，在光照低温锻炼，后剥取组培苗腋芽茎尖，制成茎尖包埋丸，再将包埋丸在蔗糖固体培养基中预培养，干燥后的茎尖包埋丸置于液氮中冷冻24 h以上；

（2）解冻及恢复后再生培养：茎尖包埋丸冷冻保存后，解冻，然后取包埋丸茎尖接种到恢复培养基上进行恢复培养和继代培养得到再生茎尖；              

（3）生根培养：取步骤二中的再生茎尖置于生根培养基中进行生根培养；

（4）炼苗移栽：将培养30-40d的生根苗的根部清洗，KMnO₄浸根，移栽至盛有灭菌蛭石的营养钵中用1/8MS营养液浇灌，然后放入培养室培养2-3 d后浇灌杀菌剂，待地上部叶色加深后转移到盛有营养土的营养钵中继续温室锻炼，生长2~3个月左右，翌年春移栽大田。

2.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤一中用于剥取茎尖的组培苗需继代60 d且腋芽饱满，并需在光照条件下低温(10±1)℃锻炼14 d。

3.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤一中茎尖包埋丸的制备：茎尖投入含有2M甘油、0.4M蔗糖和2.5%海藻酸钠的MS溶液中，然后吸取含有一个茎尖的液体转移到含有2M甘油/0.4M蔗糖h和0.1M CaC_l2的MS溶液中，室温下形成茎尖包埋丸。

4.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤二中恢复培养基为在MS培养基中每升添加1.5 mg的6-苄基嘌呤、0.02 mg的吲哚丁酸、20 g蔗糖和5 g琼脂粉，pH5.8~6.0。

5.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤二中恢复培养过程中，先暗培养7 d，后转移到光照条件下正常继代培养，30d后检测茎尖存活率和再生率，茎尖以转变为绿色为存活、最终能生成小植株为再生标准。

6.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤三中生根培养基为：1/2MS培养基中每升添加0.15 mg吲哚丁酸、0.2 mg吲哚乙酸、20 g蔗糖和5 g琼脂粉，pH5.8~6.0。

7.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤（2）（3）中培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s-1·m-2，光照时间为12 h/d。

8.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法，其特征在于：步骤四中采用的1/8MS营养液中添加吲哚乙酸。