[发明专利]基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法

权利要求书

1.基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计快速可变光脉冲激发策略，实现光合作用能流过程的分段

浮游植物细胞经暗适应后，参与Calvin循环的几种酶失去活性，重新照光后需要经过一个光合诱导期才能正常运行；在光合诱导期内，所有的电子受体均可以接收电子被还原，却不能及时给出电子被氧化，存在一个单电子周转期，不同电子受体单周转的周期不同；在单周转期内，强光照射促使能够接收电子的电子受体数快速减少至零，电子传递链被阻塞，叶绿素荧光快速上升至最大；单周转期后，电子受体再氧化给出电子，叶绿素荧光开始弛豫下降；

Q_A、Q_B和PQ单周转周期分别为100μs、1ms和10-20ms，是电子传递链中的容易产生电子阻塞的三个电子受体，本发明采用快速可变的光脉冲作激发光源，通过调节光脉冲振幅、频率、占空比和激发时序，设计不同的激发策略，选择性还原Q_A、Q_B和PQ，获取不同诱导模式下的叶绿素荧光动力学曲线；

①Q_A饱和快相荧光动力学曲线

在不造成光损伤的情况下，采用占空比大的高强度快速光脉冲，在Q_A单电子周转内产生足够高的能量累积，将其全部还原，打断光合作用的电子传递链，获得Q_A饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与Q_A之前光合能流过程有关；

②Q_B饱和快相荧光动力学曲线

Q_A单周转期后，电子向后传递给Q_B；通过降低脉冲光瞬时光强和占空比，在Q_B单周转期内使Q_A发生更多氧化还原反应，将电子传递到Q_B，将其全部还原，阻塞电子传递链，获得Q_B饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与Q_B之前光合能流过程有关；

③PQ饱和快相荧光动力学曲线

再次降低脉冲光瞬时光强和占空比，在PQ单周转期内使Q_B发生更多氧化还原反应，将电子传递到PQ，将其全部还原，阻塞光电子传递链，产生PQ饱和快相荧光动力学曲线，该曲线取决于PQ之前光合能流过程；

④PQ饱和弛豫荧光动力学曲线

PQ电子饱和后，关闭饱和光脉冲，使用微弱探测光脉冲激发，为了减小探测光对光合作用过程影响，探测光脉冲需要保持较低光强和占空比；PQ饱和模式下，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单周转期结束，PQ重新被氧化，电子向后传递，探测光脉冲诱导荧光出现弛豫下降过程，该过程仅与PQ后光合能流过程有关；

(2)分析叶绿素荧光动力学曲线，获取主导光合作用能流效率的光合参数

在浮游植物光合诱导期内，强光照射促使能够接收电子的电子受体数快速减少至零，叶绿素a分子吸收的激发能就不再参与光化学反应，表现为叶绿素荧光的快速上升；过了光合诱导期后，Calvin循环得以正常运行，叶绿素荧光开始弛豫下降；根据浮游植物光合作用能量传递模型，该叶绿素荧光动力学过程f(t)可以表示为激发光能I(t)、功能吸收截面σ_PSII、光化学反应电荷分离效率η和电子受体再氧化动力学过程的函数；

f(t)=F0+(Fm-F0)C(t)η1-C(t)(1-η)---(1)]]>

F_o为所有PSII反应中心都打开时的初始荧光，F_m为PSII反应中心全部关闭时的最大荧光，C(t)是t时刻PSII反应中心关闭比例或关闭状态。C(t)取决于激发光能I(t)至PSII的传递速率和Q_A的再氧化速率，可由下式表示：

C(t)=σPSII∫0tI(v)1-C(v)1-C(v)(1-η)g(t-v)dv---(2)]]>

函数g(t)描述了t时刻Q_A的再氧化动力学过程，取决于其后的电子传递速率可由下式表示：

然而，由于公式(1)-(3)非线性很强，不存在能够描述叶绿素荧光信号与激发信号之间函数关系的解析解。在本发明专利中，采用快速光脉冲和高速采样率测量叶绿素荧光动力学曲线，公式(1)-(3)可离散化为公式(4)-(6)的递归形式：

fn=F0+(Fm-F0)Cnη1-Cn(1-η)---(4)]]>

f_n为第n个光脉冲的叶绿素荧光采样值，C_n为第n个脉冲时PSII反应中心关闭状态，表示如下：

Cn=Cn-1Σk=14An,k+InσPSII1-Cn-1Σk-11An,k1-(1-η)Cn-1Σk-14An,k---(5)]]>

I_n为第n个光脉冲的激发能量，A_n,k取决于Q_A及其后的电子受体的再氧化动力学过程：

α_k和分别是各电子受体的再氧化幅值常数和电子传递速率，Δt是光脉冲周期；理论上通过(4)-(6)式对f_n进行拟合，便可反演得到之前列举的所有的荧光参数；

然而，(4)-(6)式中共有功能吸收截面、电子传递速率等7个光合参数，直接进行荧光动力学曲线拟合仍无法得到准确的数值解；因此，在本发明中，通过分析Q_A、Q_B和PQ饱和模式下的快相荧光和弛豫荧光，分段研究光合作用过程，以减少拟合参数个数，使拟合函数对某个或几个参数更加敏感，获得准确有效的光合参数；

①Q_A饱和快相荧光分析

QA饱和模式下，电荷在Q_A处累积，电子传递链中断，荧光快速上升，得到PSII的最大荧光产率F_m、初始荧光产率F_o；该快相荧光过程与Q_A后的电子传递过程无关，(4)-(6)式得以简化：

fn=F0+(Fm-Fo)Cnη1-Cn(1-η)---(7)]]>

Cn=Cn-1+InσPSII1-Cn-11-(1-η)Cn-1---(8)]]>

通过(7)、(8)式对Q_A饱和模式的快相荧光进行曲线拟合，可得到有效吸收截面σ_PSII和电荷分离效率η。同时,可计算出最大光量子效率Δφ＝(F_n-F₀)/F_m；

②Q_B饱和快相荧光分析

Q_B饱和模式下，电荷在Q_B处累积，该快相荧光过程与Q_B后的电子传递过程无关，Fo、Fm、σ_PSII和η保持不变且已知，通过(4)-(6)式分析Q_B饱和下的快相荧光曲线能够准确得到Q_A到Q_B间电子传递速率

③PQ饱和快相荧光分析

PQ饱和模式下，电荷在PQ处累积，该快相荧光过程与PQ后的电子传递过程无关，同理通过Q_B饱和下的快相荧光分析可准确得到Q_B到PQ间电子传递速率

④PQ饱和弛豫荧光分析

PQ电子饱和后，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单周转期结束，PQ再氧化过程开启，在PQ处累积的电荷向后传递，光合作用正向电子传递效率非常高，逆向电子传递过程可以忽略，荧光呈现弛豫下降过程，该过程仅与PQ后光合能流过程有关。通过(5)式，即可拟合出PQ至PSI电子传递速率和PSI至Fd的电子传递速率

(3)结合生物膜能流理论，建立浮游植物光合速率叶绿素荧光分析方法

浮游植物光合速率是活体细胞对光能吸收、转化和利用效率，即参与光化学反应能量占激发光能量的比例；根据生物膜能流理论，浮游植物光合速率与最大光量子效率，光能的吸收效率σ_PSII，电荷分离效率η，以及Q_A、Q_B、PQ、PSI和Fd等主要电子受体间的电子传递速率等光合参数线性相关，具体可由(9)式计算：

通过(9)式建立基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率的定量分析方法，实现浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速检测。

2.根据权利要求1所述的基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法，其特征在于，所述方法也可用于高等植物光合速率快速测定。