[发明专利]家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe2基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要是鳞翅目害虫防治和家蚕抗药性品种改良领域。

背景技术

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferase,GSTs,EC 2.5.1.18)是一类重要的同工酶超家族，广泛分布于动物、植物、酵母、细菌等生物体中，具有对内源和外源性有毒物质解毒的功能。在昆虫体内它不但行使对有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类杀虫剂的解毒，而且也具有消除昆虫体内因杀虫剂等因素引起的的脂质过氧化物，保持体内的氧化与抗氧化的动态平衡。

杀虫剂在害虫防治中起着非常重要的作用，但是随着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们加大药剂的用量，这不但制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响到了经济和人类的可持续性发展。GSTs作为昆虫重要的解毒酶系，已有少许研究鉴定了GSTs基因在杀虫剂抗性中的作用，但因杀虫剂靶标有限严重制约了新型高效杀虫剂的研发。家蚕作为鳞翅目的模式昆虫，而且也是重要的经济昆虫。我们以杀虫剂连续多代筛选的家蚕为材料，克隆获得一个在筛选品系中高表达的谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe2基因。通过体外表达的酶活性鉴定，杀虫剂体外抑制酶活性及组织表达定位等研究，证实该基因与家蚕杀虫剂抗性相关。通过这一基因靶点，有望设计出防治鳞翅目害虫的药物，并用于家蚕抗药性品种的分子改良。因此，在农林害虫的防治和品种改良中有着重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明是利用了生物信息学，分子和细胞生物学方法，证实了BmGSTE2具有体外代谢CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯)和CHP(过氧化氢异丙苯)的活性，并与杀虫剂相互作用的功能。目的在于以此为靶点开发新的杀虫剂药物及改良家蚕抗药性品种。

本发明申请人用2种杀虫剂对家蚕分别进行多代连续筛选，获得耐药性品系后，利用RT-PCR发现BmGSTe2基因的表达水平在经筛选后的家蚕中显著提升。通过对BmGSTe2进行克隆和异源表达，获得BmGSTE2重组蛋白，对其进行酶特性和活性分析；同时制备了多克隆抗体，经免疫印迹和免疫组化鉴定了BmGSTE2蛋白的组织表达和细胞分布情况。结果证实BmGSTE2的高表达是增强家蚕耐药性的原因之一。

本发明的家蚕抗药性基因BmGSTe2通过以下步骤获得和证实：

(1)BmGSTe2与家蚕耐药性的初步鉴定

以甲氰菊酯(fenpropathrin)和辛硫磷(phoxim)分别对家蚕19-440品系(F₀)进行4代和5代筛选，并标记为F₄和F₅品系。经筛选后F₄对甲氰菊酯的致死中浓度(LD₅₀)为F₀的4.2倍，F₅对辛硫磷的LD₅₀为F₀的1.8倍，表明杀虫剂筛选显著提高了家蚕耐药性。本实验以添加杀虫剂的桑叶喂食家蚕用于筛选，分离出F₀，F₄和F₅品系雌雄个体的中肠，提取总RNA并反转录cDNA。下载NCBI中其他昆虫GST蛋白序列，与家蚕基因组进行同源比对，获得家蚕GST基因序列。并利用RT-PCR方法鉴定家蚕GST家族基因在筛选前后的表达变化。结果表明BmGSTe2的表达较筛选前有显著提高(图1)，暗示BmGSTe2与筛选后家蚕的耐药性形成相关。

(2)BmGSTe2的克隆与序列分析

BmGSTe2的克隆：提取家蚕中肠组织的总RNA并反转录获得cDNA，以BmGSTe2特异引物(正向：5'-GGATCCATGTCTATAATTATTTACCAAACAT-3'，反向：5'-GCGGCCGCGACAGGAAAGCAATTCAATAGTT-3'，下划线分别为限制性内切酶NdeI和BamHI酶切位点)进行PCR扩增。胶回收纯化扩增获得的BmGSTe2DNA片段，以NdeI和BamHI双酶切并回收目的产物，与酶切后的pET-28a载体经T4连接酶连接构建重组表达载体，转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致。