[发明专利]一种获得斗鸡特异性分子标记的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。 

技术背景：

斗鸡是世界各地几乎都有的娱乐传统，利用鸡形目的鸟(也有其他目的)在发情期好斗的特点来进行比赛。斗鸡是供竞赛和娱乐用的鸡品种，以善打善斗而著称的珍禽，又名打鸡、咬鸡、军鸡。斗鸡中的河南斗鸡是中国古老鸡种之一。在中国斗鸡品种中体型最大，数量最多，其胸、腿肌发达，可作为肉鸡育种的原始素材，主产于河南省开封、郑州、洛阳、周口等市。河南斗鸡体质类型有4种，粗糙疏松型、细致型、紧凑型和细致紧凑型。 

长期以来，主要是以常规形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴定。形态学标记分析简便、经济，但由于形态学特征常常受环境因素的影响，具有表型可塑性和遗传可变性，容易导致不正确的分类与鉴定；并且形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元，应用分子生物学技术将有利于品种鉴定。形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学家队伍，使分类学的发展面临巨大的挑战。 

本发明利用高通量测序手段对不同鸡种进行测序，通过对不同鸡种间的DNA序列进行筛查比对，找到在不同鸡种间出现的特异性序列，并对这段序列设计引物进行PCR扩增和重测序验证，以期通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以对不同鸡种进行更精确的分类。 

发明内容：

本发明的目的是获得斗鸡特异性的分子标记。 

本发明的技术方案是： 

一种获得斗鸡特异性分子标记的方法，其特征在于：通过目标区域捕获测序筛查27种鸡种的16号染色体，并利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo软件设计引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证，根据分析结果即可得到斗鸡特异性的分子标记，即CATTCCCGTTCCCGTTCG，具体步骤如下： 

材料与方法 

1.1实验材料 

选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、太湖鸡、溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡、广西黄鸡27种不同鸡种； 

1.2目标区域捕获测序 

对每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0.4ml，加入0.5mol/LNa₂EDTA抗凝剂2μL，加入裂解液4ml后于4℃保存备用；利用苯酚抽提法提取DNA，送入华大基因公司进行目标捕获测序，选取Gallus_gallus-4.0作为参考基因组； 

1.3序列比对 

目标区域捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5.1对不同鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况； 

1.4引物设计 

根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列，利用不同鸡种DNA作为模板，并利用Oligo软件设计引物进行PCR扩增，引物名称为：DOUJI；座位：chromosome16；5′-3′的引物序列为：F:CCGCGCTGACCTCGTCTCGCTGTGT，R:CTCGGCGGGGCAGCAGCTAATTCAG；退火温度：66.3℃； 

1.5PCR扩增和检测 

PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为100ng/μL，2μL10×PCRBuffer，1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，ddH2O13.3μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用；把PCR产物进行测序并用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压为100V，电泳40min； 

结果 

通过目标区域捕获测序，发现了斗鸡与其他鸡种存在差异的一段序列，设计引物PCR扩增进行重测序并用琼脂糖凝胶电泳进行验证，发现斗鸡与其他鸡种 在这段序列上存在特异性差异，差异在于：在这段序列上斗鸡存在特异性的18个bp的缺失，即CATTCCCGTTCCCGTTCG。 

本发明的有点是应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。 

附图说明

附图1为斗鸡与其他鸡种序列示意图； 

附图2为斗鸡与其他鸡种琼脂糖凝胶电泳图。 

具体实施方式