[发明专利]用于具有3’-5’外切活性的核酸酶检测的硫代探针

说明书

本申请是申请日为2013年6月17日，申请号为201310239614.0的发明专利申请“硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针及其在核酸酶检测中的应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及核酸酶的检测，更具体地，涉及硫代(硫酰化)修饰寡聚核苷酸荧光探针，以及利用该荧光探针对实际生物体系中具有3’-5’外切活性的核酸酶进行检测。

背景技术

DNA是生命体遗传信息的载体，核酸酶确保了基因复制的准确性和遗传的稳定性。核酸酶广泛存在于生物体系。核酸与核酸酶之间的相互作用是传递遗传信息的重要过程，包括复制，重组和修复。不正常的酶活动通常会导致疾病，核酸酶组学研究的更重要的意义在于疾病的诊断和药物的研发。因此，发展灵敏度高且选择性强的检测核酸酶的技术成为现代分子生物学和药物研发的一项重要任务。

对于核酸酶的检测分析，传统方法一般是利用凝胶电泳、液相色谱等手段来分析核酸酶与底物反应后的产物，这些方法都操作繁琐，无法快速、方便地获取分析结果，而且通常还需要采用放射性元素标记，对环境不友好。另外，酶联免疫吸附分析法(ELISA)也被用于酶切反应的研究。但是这种方法需要大量的时间来制备抗体，而且很难发展成为均相检测体系。近几年来，利用荧光核酸探针来检测核酸酶在该领域得到了广泛的应用。这种探针具备实时检测核酸酶活性的能力，免除放射性标记，而且由于是荧光方法，所以灵敏度一般比传统方法要高。这种探针的工作原理主要是通过荧光共振能量转移对目标DNA与核酸酶反应前后体系荧光的变化进行实时的监测。这种探针的结构类似于分子信标(Molecular Beacon)——呈发夹结构的短链DNA，一端标记荧光基团，一端标记猝灭基团。在进行核酸酶活性分析中，探针与核酸酶相互作用导致分子信标的结构发生变化，从而由荧光信号实时指示核酸酶的动力学作用过程。但是由于很多复杂的生物体系有多种核酸酶共存，这种分子信标结构的探针可以与多种核酸酶同时发生相互作用，导致很难找出目标酶的信号。虽然我们可以通过设计对照探针来区分假阳性信号，但这样会大大降低探针的灵敏度，而且如果目标酶的含量低，采用对照探针也达不到区分的目的。在这种情况下，往往还是需要对酶反应的产物进行分析，这样不仅增加了设计成本和工作量，而且丧失了荧光核酸探针的检测优势。因此，迫切需要开发出灵敏度高、选择性好、快速、实时、成本低、准确可靠的核酸酶实时检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于实时检测核酸外切酶活性、选择性好、灵敏度高、速度快、成本低、准确可靠的分析方法，以克服现有技术中的诸多局限。

本发明的技术方案是，利用硫代核酸骨架对核酸酶的抑制作用，设计硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针，来实现对核酸外切酶的特异性检测。这些探针的信号产生是依赖于荧光基团和猝灭基团之间的荧光共振能量转移(FRET)作用。在没有目标酶存在时，荧光基团与猝灭基团靠近，荧光处于猝灭状态。当目标酶与荧光探针发生反应时，探针结构发生变化，导致两个基团分离，从而荧光恢复。

所谓硫代核酸骨架是指：DNA的磷酸二酯键中的O^-被S^-取代。核酸酶与DNA的反应一般都包含磷酸二酯键的水解，水解机理涉及到游离水分子的氧进攻DNA的磷酸二酯键中的磷。当这种硫代骨架存在时，由于磷酸二酯键中的磷的电负性发生变化，亲电能力变差，因此酯键在核酸酶的存在下不能被水解。而DNA中未硫酰化的部分仍然可以被相应的核酸酶水解。利用这一性质，我们针对不同的核酸外切酶的性质，设计优化了部分硫酰化的三种探针分别用于对三类核酸外切酶进行特异性检测。

由于大部分核酸酶都识别DNA双链结构，本发明设计了硫代修饰的自杂交发夹型双标记探针(简称硫代探针)，其中环部为单链结构，由4-8个核苷酸组成，而茎部结构较长，由8-15对核苷酸组成，以利于核酸酶的识别和水解作用。根据待测核酸外切酶的活性功能设计分为非限制性核酸内切酶探针、核酸外切酶探针和脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP site)内切酶探针三种设计(参见图1)：

1)非限制性核酸内切酶探针

非限制性核酸内切酶可以作用于单链DNA、双链DNA、染色质和RNA:DNA杂交链，切割DNA产生二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物。本发明中所使用的非限制性内切酶是DNaseI，这种酶与DNA作用产生3’羟基和5’磷酸末端。这种酶的特点是不依赖DNA的特定序列对DNA进行降解。如果核酸中含有人为设计的硫代核酸骨架，则DNase I从那些非硫酰化的部分开始降解。