[发明专利]一种水稻真空渗透遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻真空渗透遗传转化方法，属于基因工程和分子生物学实验技术领域。

背景技术

水稻是全球一半以上人口主要的粮食作物，然而，水稻生产受到越来越多不利因素（如病虫害等）的限制，因此，水稻品种的改良十分迫切。转基因技术能突破生物种间障碍，实现物种间基因的转移，从而为作物遗传改良提供了新途径。利用转基因技术对水稻进行遗传改良的成功与否，很大程度上依赖于有效的遗传转化方法的开发和应用。现在，公知的水稻遗传转化方法一般分为2类：一类是直接的基因转化（包括基因枪法、电击法、PEG法、脂质体转化法和花粉管通道法等），这类方法往往因为成本高，操作技术繁琐而极少应用；另一类是由载体介导的转化，目前应用较为广泛的是农杆菌介导法，利用该方法在水稻上已成功获得一些具有抗病虫害、抗逆等优异性状的转基因材料。

然而传统的农杆菌介导法明显地存在许多不足：转化的实现必须经过对成熟种胚等外植体进行愈伤诱导、胚性愈伤继代、胚性愈伤与农杆菌共培养、抗性愈伤筛选及抗性愈伤分化出苗等至少近4个月的组织培养过程，其转化操作繁琐且周期长，人财物花费大，而且对操作者的技术要求高；其次在近4个月的组织培养过程中，易发生体细胞变异、形态畸形、染色体数目改变和育性丧失等问题，造成遗传背景复杂化；再者得到的转化植株常出现基因沉默，转化效率低。因此，开发一种无需经过组培过程，具有简便、快速和高效等优势，只需对开花前的活体植株短暂真空处理即实现外源基因向植株转化的水稻真空渗透转化法，便成为水稻基因转化的另一重要途径。

尽管目前有关真空渗透转化法成功应用的研究报道很多，但基本只局限在拟南芥、芥菜、白菜、菜薹、甘蓝型油菜、萝卜、烟草等等个体较小的植物上应用，而且转化率偏低，真正获得的有应用价值的转基因植物较少。现有的真空渗透遗传转化大多是用现成的、体积较小的真空干燥器（如图14所示）作为真空渗透遗传转化装置，其基本操作是：将渗透转化液倒入真空干燥器，除拟南芥用活体植株进行转化外，其余植物（如芥菜、白菜、菜薹、甘蓝型油菜、萝卜、烟草等）均是将待转化植株直接从培养钵中拔出、洗净后，先将待转化植株全株或部分浸泡在真空干燥器中的渗透转化液中，此时真空干燥器处于常压状态，然而植株已浸泡在渗透转化液中开始了渗透遗传转化，然后，再用真空泵减压使真空干燥器达到真空状态，继续在真空状态下渗透遗传转化（即真空处理），达到预定时间后（即完成渗透遗传转化），关闭真空泵开关，打开真空干燥器通气阀门，待恢复常压后,揭开干燥器盖，取出植株种植在培养钵中或田间。拟南芥真空渗透遗传转化不同的是，由于拟南芥植株较小（20-30cm）,一般是在真空干燥器中放置装有渗透转化液的烧杯，然后将种植在营养钵里的拟南芥活体植株连同营养钵一起倒置浸入在烧杯中，然后如上所述进行真空渗透转化。现有的真空渗透转化装置存在以下不足：（1）采用现有的真空干燥器进行的真空渗透转化，在抽真空减压之前，植株已经浸泡在容器内的农杆菌渗透液（渗透转化液）中，虽然容器内的植株和渗透液还处于常压状态，但是植株浸泡在容器内的农杆菌渗透液中已经开始了遗传转化，其转化过程可以说包含了部分常压下的渗透转化和部分真空的渗透转化，并没有真正实现真空渗透遗传转化，其农杆菌对植株的侵染力降低，转化效率也随之降低。这可能也是目前真空渗透转化法转化效率偏低的主要原因。（2）现有的真空干燥器由于受体积较小、没有适宜活体植物放置的相应配套部件以及操作不方便等因素限制，使水稻、花卉、棉花、麦类等个体较大作物不能实现原种植条件的活体状态（即原位条件）下进行渗透遗传转化，多采用将受体植株挖出，将其直接倒放于容器中进行转化，转化后又移栽的操作方式，一方面并不是真正的原位转化，另一方面对转化后植株的生长状态、健壮程度和结实率均有影响，进而造成真空渗透转化效率偏低。（3）即便像拟南芥这样小的活体植株的真空渗透遗传转化操作，也存在许多侧枝被压断，导致处理转化效果低的问题。综上所述，现有的真空渗透转化装置及其转化方法并不适于水稻等作物的真空渗透遗传转化，因此设计和开发出一种操作简便、快速和高效的适于水稻等作物的真空渗透遗传转化装置及其及其转化方法，这将极大地缩短转化周期、节约科研成本，提高转化效率，为作物品种的遗传改良和基因功能研究提供强有力的技术保障。

发明内容

为克服现有真空渗透遗传转化装置未真正在真空状态下实现渗透遗传转化和不适于水稻等个体较大作物的不足，本发明提供一种真正在真空状态下、操作简便、实现水稻原位真空渗透遗传转化的方法。