[发明专利]一种表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途

权利要求书

1.一种表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型；

饲养所述转基因小鼠模型的小鼠至1周龄，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞产生受巢蛋白增强子控制的增强型绿色荧光蛋白；

将上述单个细胞通过流式细胞仪进行分选，用C57B/6小鼠细胞做阴性对照细胞，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的睾丸间质干细胞。

2.如权利要求1所述的表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型包含以巢蛋白启动子驱动表达增强型绿色荧光蛋白的质粒，其中，包括上游翻译位点的启动子区域长2.5kb，包含第二个外显子3’到第三个内含子5’的增强子区域长1.8kb，多聚腺苷化位点与增强型绿色荧光蛋白cDNA连接。

3.如权利要求1或2所述的表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述的分离方法的具体步骤如下：

利用C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型；利用出生后7天Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含1％双抗的1×PBS反复冲洗，随后用吸管及枪头轻轻吹打，尽量使间质组织与曲精细管分散开，并用小剪刀剪碎组织部分，随后放入1mg/ml的IV型胶原酶溶液，于37℃、5％CO₂条件下孵育15min，加入大量含0.5％BSA的1×PBS终止胶原酶的消化，1500rmp离心5min；弃去上清液，用孔径为40μm的尼龙网过滤悬液，去除曲细精管，收集的滤液以1500rmp离心5min后，将Nestin-GFP的阳性细胞悬液样本和正常C57BL/6的阴性对照细胞样本，经流式分选收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的睾丸间质干细胞。

4.一种培养如权利要求1-3任一项所述的方法得到的表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的方法，其特征在于：将分离得到的表达巢蛋白的睾丸间质干细胞在培养基中进行培养，产生自我更新和增殖的细胞，所述的培养基为无血清培养基，其成分包括：DMEM-F12培养基中加入1nM地塞米松、1ng/ml LIF,5mg/liter insulin,5mg/litertransferrin,5ug/liter sodium selenite的ITS、5％鸡胚提取物、0.1mMβ-巯基乙醇、1％非必需氨基酸、1％N2、2％B27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBB、20ng/ml OSM。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的方法得到的表达巢蛋白的睾丸间质干细胞用于制备治疗睾酮水平低下导致相关疾病的药物的用途。