[发明专利]基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及贝类腹泻性毒素检测分析技术，尤其涉及一种基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法。

背景技术

海洋水产品腹泻性毒素是一类毒性很强的非蛋白毒素，是贝类通过捕食浮游藻类而将有害有机物质聚集于体内富集而成。人在食用后会导致中毒，甚至死亡。目前国内海洋水产品腹泻性毒素检测方法通常使用小鼠生物实验法(MBA)，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)和酶联免疫检测技术(ELISA)等。MBA方法所需实验量巨大且存在很大的个体差异性，在毒素的毒力水平上可能被低估。HPLC-MS虽然具有检测范围广的优点，但其设备庞大并且价格昂贵。ELISA等酶联免疫检测技术同样存在价格昂贵和检测成本高等不足。细胞图像传感器采用离体的心肌细胞培养，构建高性能且成本低廉的细胞图像传感器，用于海洋水产品腹泻性毒素的检测分析。此外，采用图像分析的检测方法，能直观，长时间并且单一性地观察毒素对细胞的作用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法，该方法在贝类腹泻性毒素检测分析系统上实现，所述贝类腹泻性毒素检测分析系统包括：CCD摄像头、心肌细胞传感器培养板、倒立显微镜和计算机；其中，心肌细胞传感器培养板固定在倒立显微镜的载物台上；CCD摄像头固定在倒立显微镜上方；CCD摄像头通过USB连接线与计算机连接；该方法包括以下步骤：

（1）心肌细胞的培养：获取待测心肌细胞，在高糖培养基中培养，制成细胞悬液；经过活细胞计数后，将原细胞悬液配制成170,000个/ml的细胞悬液；最后在心肌细胞传感器培养板中任意选择一个孔中加入100μl细胞悬液，使孔中细胞数量为17000个/孔，将心肌细胞传感器培养板置于培养箱培养96小时，使得心肌细胞良好贴附于心肌细胞传感器培养板上，构建出细胞图像传感器；

（2）配制待测腹泻性毒素的工作液：用二甲基亚砜(DMSO)配制成200μg/L的标准样品溶液储存液，用高糖培养基依次稀释储存液，得到至少三个不同浓度梯度的工作液；

（3）对照组心机细胞机械搏动状态检测：首先将心肌细胞传感器培养板放置在倒立显微镜的在载物台上，使用40倍物镜和10倍目镜，调整倒立显微镜载物台的位置和调焦旋钮，在视野中能清晰看到心肌细胞；通过计算机控制CCD摄像头进行心机细胞搏动图像采集，然后计算心机细胞机械搏动曲线；最后通过心机细胞机械搏动曲线计算对照组搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数，具体包括以下子步骤：

（3.1）将采集的心肌细胞搏动图像的第一帧作为对照帧图像；

（3.2）将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为：

Gray=R×0.299+G×0.587+B×0.114

其中，Gray指图像像素二值化后的灰度值，R、G和B分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值；

（3.3）采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将T记为图像前景和背景的分割阈值，w₀记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为u₀；w₁为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为u1；将u记为图像的总平均灰度，计算公式为u=w₀×u₀+w₁×u₁；G记为最大类间方差，从最小灰度到最大灰度值遍历T，依据计算公式G=w₀×(u₀-u)²+w1×(u₁-u)²，当T使得G最大时，取此时的T为最佳的分割阈值；然后依据T，将图像像素灰度值小于T的取为0，图像像素灰度值大于T的取为1，实现灰度图像的二值化；

（3.4）采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤（3.2）和（3.3）对实时帧图像进行灰度化和二值化处理；

（3.5）将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为-1、0和1三者其中之一；

（3.6）对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值；