[发明专利]一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体及该疫霉诱导性基因启动子和重组表达载体的应用。

背景技术

有效控制植物病害一直是植物病理学研究的核心问题。长期以来，使用化学农药是病害控制的主要技术，但在实际应用中面临的问题是：一方面缺少有效的药剂，另一方面在用药的过程中伴随的药害，环境污染等问题。后来又提出抗病育种策略，但因其周期长，成本高，规模大，精准度低等一系列的问题，很难进行推广应用。随着分子生物学和生物技术的发展，进一步提出了抗病基因工程的策略，但伴随的问题是：当组成性表达一个防卫反应相关基因时，很难控制基因表达的精准度，往往会影响植物的正常生长发育。而病原诱导性启动子可能为解决这一问题提供新的希望，因为病原诱导性启动子能在时空上精准的调控基因在病原侵染点特异表达。

大豆是世界上最重要的油料经济作物，也是最大的食用油和食用蛋白的来源。由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根、茎、苗和种子的腐烂病是一种重要的大豆病害，该病害在世界范围内的大豆种植区几乎都可以检测到，它严重影响着大豆的产量和质量，每年都造成巨大的经济损失。大豆疫霉属于卵菌，为土传病害，很多控制真菌的常用方法对此病害的控制效果都不明显。目前控制大豆疫霉病害的主要方法是选育抗病品种，但在生产上持续种植具有单一抗性的品种，其抗性会随着大豆疫霉菌的快速变异而丧失。利用多基因控制的水平抗性也是生产上的一种常用策略，这种抗性虽然是可遗传的，但是由于参与抗性的基因较多，常规育种的方法很难将其聚合到一个品种上。因此利用抗病转基因工程策略，在大豆中筛选出疫霉诱导性启动子，将为大豆抗疫霉根腐病育种提供有价值的启动子。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中对大豆疫霉控制方法复杂、控制效果不明显，而新型的抗病基因工程技术中缺少可用的病原诱导性启动子的问题，提供一个疫霉菌诱导性启动子。该启动子来源于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因，将该启动子构建在植物表达载体pMDC162中，能在疫霉的诱导下特异的驱动下游GUS报告基因的上调表达。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1.本发明提供一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体，该重组表达载体包括疫霉诱导性启动子，并包括由该启动子调控表达的报告基因；其中，疫霉诱导性启动子位于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因，GenBank:XM_003546586.2的转录起始位点ATG至上游1,500bp的区域。

该启动子区主要包含三类顺式作用元件：第一类是基础表达元件包括14个CAAT-box，一个TAAT-box；第二类是病原诱导性顺式作用元件，如有约20个GT-1元件，约5个W-box，3个WRKY转录因结合元件；第三类是物理因素或激素诱导反应顺式作用元件，如包含1个赤霉素反应元件GARE，1个赤霉素反应核心元件MYB，一个乙烯诱导反应元件LEC，5个细胞分裂素诱导反应元件ARR1，2个脱落酸反应元件RY repeat，1个脱落酸或胁迫反应元件E-box，一个暗诱导反应元件ACGT等。该启动子能够在疫霉菌侵染初期，快速的驱动其下游基因的上调表达。

2.上述1提供的重组表达载体，其中，所述报告基因为GUS报告基因，疫霉诱导性启动子在GUS报告基因的上游，可以在疫霉菌的诱导下驱动GUS报告基因的表达。

选择GUS报告基因与疫霉诱导性启动子结合，利于检测疫霉诱导性启动子的这种病原菌诱导表达特征；当然，如果采用任何生物技术领域可用的报告基因与该疫霉诱导性启动子结合，能达到同样的目的，均可，比如绿色荧光蛋白GFP等。

3.上述1或2提供的重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体的出发载体为植物表达载体pMDC162。

出发载体采用植物表达载体并不是唯一，本发明列举出的植物表达载体pMDC162只是一种更适合用于本发明提供的目的基因的转化。

4.本发明还提供疫霉诱导性基因启动子在构建含有疫霉诱导性启动子的重组表达载体上的应用。

5.本发明还提供疫霉诱导性基因启动子在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应用。

6.上述5提供的大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的启动子在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应用，其中，该转基因植物为烟草或大豆。

7.本发明还提供一种宿主细胞，其包括上述1-3任一项所述重组表达载体。