[发明专利]桑树非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及到一种来源于桑树水通道蛋白中的磷脂酰肌醇4，5二磷酸(phosphatidylinositol(4，5)-bisphosphate，PIP2)基因启动子的克隆，及其在逆境(干旱、低温、PEG-6000模拟干旱、盐、抗病感病)胁迫下的表达模式。

背景技术

植物在生长发育过程中，常常会受到诸多不良逆境如干旱、低温、盐渍等因素引起的脱水胁迫的影响，会引起其体内发生一系列复杂的生理生化变化。蛋白质的合成途径受到抑制，同时产生许多新蛋白来应对危机。植物水通道蛋白是一类位于细胞质膜上专一性运输水的蛋白。盐胁迫通过在分子水平上影响水通道蛋白的特性和丰度，来改变细胞对水分的吸收，降低细胞渗透压，缓解盐对植物的伤害。但植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用，植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是转录调控的中心，因此通过对PIP2启动子序列的克隆和分析，将为阐明这个基因在非生物胁迫应答途径中的作用奠定基础。

水孔蛋白(aquaporin，AQP)是一种选择性水转运膜内在蛋白(membrane intrinsic proteins，MIP)，分子量约为24-30kDa，存在于许多植物、动物和微生物的生物膜上。植物水孔蛋白根据氨基酸序列的同源性和亚细胞定位，通常把其分为4大类：①质膜内在蛋白(plasmamembrane intrinsic proteins，PIPs)，主要分布在细胞质膜上；②根瘤菌共生膜上的NOD26内在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)及类似物；③液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins，TIPs)，主要位于液泡膜上，分为α、β、γ、δ和ε-TIP五个亚类；④小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins，SIPs)，可分为SIP 1和SIP2两个亚类。

植物水孔蛋白基因不仅具有丰富的多样性还有极高的丰度。这种多样性表现在种间多样性的分布和表现在种内组织、器官和细胞上的时空特异性。在当前已知的所有高等植物PIPs中，它们都具有两个高度保守的相同区域，分别位于C环和E环上，猜测可能与PIPs功能的特异性有关。根据N-端和C-端的不同，可以将PIPs分为PIP 1和PIP2两类，二者有极高的相似度，区别是PIP1比PIP2拥有更长的N-端和较短的C-端，并且在序列当中各自都有相应的保守氨基酸。另外，水通道蛋白PIP2亚家族貌似比PIP 1运输水分的效率更高，在爪蟾卵母细胞的功能分析时，发现PIP2增加卵母细胞膜水分的渗透性大约为10到20倍的效率，而PIP 1水孔蛋白对于膜的透水性没有影响或者影响极低。随着PIP2的发现并被克隆，人们发现PIP2亚家族的各个蛋白在不同的物种中也显现出不同的生物学功能，并证明了它们对植物不同的生理进程起着非常重要的作用。这些水通道蛋白可在根系、叶片、生殖器官和种子萌发等生长发育过程中参与水分的运输。

桑树作为应用于蚕桑产业一种重要的经济作物，是家蚕(Bombyx mori)的唯一饲料来源。我们用已克隆得到的鲁桑品种(Morus multicaulis)育71-1MmPIP2基因全长序列设计引物通过染色体步移的方法获得该基因的启动子序列。用PLACE中的plant care软件对该序列进行了分析，启动子元件预测结果显示：在鲁桑育71-1的PIP2启动子中除了转录必须的TATA-box、GATA-box以及CAAT-box等保守元件外，还存在一些感应环境胁迫、光、水分、激素应答及生长发育调节的元件，如响应参与光调节的AE-box、AT 1-motif、G-box、GAG以及GATA-motif、I-box等，脱落酸应答因子ABRE、胚乳表达因子Skn-1motif，植物激素应答因子TGA-element，细胞周期调控应答因子MSA-like等。并采用qRT-PCR的方法检测MmPIP2基因启动子在干旱、低温、PEG模拟干旱胁迫和盐胁迫以及抗病感病几种条件下的表达模式。

发明内容

解决的技术问题：本发明旨在提供桑树非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用，该启动子属于水通道蛋白家族新成员，内容涉及其cDNA全长序列、功能域分析，该基因在干旱、低温、PEG-6000模拟干旱、盐、抗病感病逆境的诱导下的表达模式及应用。

技术方案：一种桑树非生物胁迫特异性表达的启动子，为如下(1)、(2)或(3)所示：